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        實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人感染狂犬病病毒的分析報(bào)告

        2019-09-10 23:34:22何芝菲
        大科技·C版 2019年1期
        關(guān)鍵詞:實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

        何芝菲

        摘 ? ?要:狂犬病是一種由狂犬病病毒引起的烈性傳染病。本試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)一例疑似人感染狂犬病病毒的病例分7個(gè)時(shí)段采集其尿液及唾液標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。結(jié)果顯示,7個(gè)唾液樣本狂犬病病毒均為陽性,7個(gè)尿液樣本中5個(gè)樣本為陽性,2個(gè)樣本為陰性,唾液樣本Ct值明顯優(yōu)于尿液樣本。本試驗(yàn)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用到臨床檢測(cè)狂犬病病毒具有重要的參考價(jià)值。

        關(guān)鍵詞:狂犬病病毒;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;檢測(cè)

        中圖分類號(hào):S852.65 ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào):1004-7344(2019)03-0272-02

        狂犬病(rabies)是由狂犬病毒(rabiesvirus,RABV)所致的人獸共患急性傳染病,發(fā)病后死亡率接近100%。全球每年約有5.5萬人死于狂犬病,我國(guó)是狂犬病高發(fā)地區(qū),因感染狂犬病死亡的人數(shù)居世界第二[1]。在我國(guó),狂犬病是國(guó)家重點(diǎn)防控的乙類傳染病。近年來,由于我國(guó)養(yǎng)犬、貓等寵物的家庭日漸增多,該病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]。據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心2017年的最新統(tǒng)計(jì),2017年全國(guó)狂犬病發(fā)病數(shù)為516人,死亡502人。

        狂犬病毒屬于彈狀病毒(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬,是單股負(fù)鏈RNA病毒,基因組長(zhǎng)度為11928~11932nt,編碼5種蛋白結(jié)構(gòu),5種蛋白對(duì)應(yīng)5種結(jié)構(gòu)基因編碼,其中N基因具有毒株間的相對(duì)保守性和高拷貝復(fù)制性,是分子診斷的目標(biāo)序列[3]。近年來,隨著分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,核酸診斷技術(shù)被應(yīng)用到狂犬病的診斷中。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-TimePCR)是基于傳統(tǒng)PCR上發(fā)展起來的新技術(shù),具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)核算拷貝數(shù)量、靈敏度高、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于病毒性病原體的快速檢測(cè)中[4]。目前,國(guó)內(nèi)鮮有采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)人體感染狂犬病病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道。本試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)一例人感染狂犬病病毒的病例進(jìn)行取樣檢測(cè),旨在為實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用到臨床檢測(cè)狂犬病病毒提供參考。

        1 ?材料與方法

        1.1 ?標(biāo)本信息

        患者劉某,男,53歲,重慶市潼南區(qū)人。該患者于2018年7月被犬咬傷手臂,暴露程度Ⅲ度,傷口未處理。劉某于2018年11月28日出現(xiàn)煩躁、恐水、怕風(fēng)、抽出等癥狀,并于12月1日入院。2018年12月3日晚間19點(diǎn)至4日早上7點(diǎn)期間,時(shí)隔2h對(duì)患者中段尿及唾液進(jìn)行采集,共計(jì)14個(gè)樣本(1~7號(hào)為尿液樣本,8~14號(hào)為唾液樣本),采集后的樣品于-20℃下保存。

        1.2 ?試劑與儀器

        病毒核酸提取試劑盒(磁珠法)和狂犬病毒核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)均購自江蘇碩世生物科技有限公司,Real-TimePCRSystem(stepone),全自動(dòng)核酸提取儀(SSNP-2000A)。

        1.3 ?方 法

        1.3.1 ?核酸提取

        將樣品于室溫條件下融凍,向病毒核酸提取試劑盒對(duì)應(yīng)孔位分別加入樣品200μl,置于全自動(dòng)核酸提取儀中進(jìn)行核酸提取,具體操作見說明書。提取完成后吸出樣品核酸于保存管中,-20℃下保存。

        1.3.2 ?實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

        ①反應(yīng)體系:每人份PT-PCR反應(yīng)液7.5μl,酶混合液5μl,狂犬病反應(yīng)液4μl,去RNA酶水3.5μl,樣品5μl,總體積25μl。②反應(yīng)條件:逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)50℃30min,預(yù)變性95℃5min,變性95℃10s,退火、延伸及檢測(cè)熒光55℃40s45個(gè)循環(huán)。

        1.3.3 ?結(jié)果判定方法

        (1)陽性對(duì)照:Ct≤30且擴(kuò)增曲線呈典型S型顯示。

        (2)陰性對(duì)照:無典型S型擴(kuò)增曲線顯示。

        (3)樣本陽性:Ct≤35且曲線呈S型。若樣本檢測(cè)結(jié)果35(4)樣本陰性:Ct>38或者未檢出。

        2 ?結(jié) 果

        2.1 ?實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)尿液樣品檢測(cè)結(jié)果

        對(duì)7個(gè)時(shí)段采集的病人中段尿樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果見圖1,由圖可知2號(hào)和6號(hào)樣本為陰性,其余樣本實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Ct值分別為1號(hào):35.68,3號(hào):35.77,4號(hào):36.63,5號(hào):36.12,7號(hào):35.92。

        2.2 ?實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)唾液樣品檢測(cè)結(jié)果

        對(duì)7個(gè)時(shí)段采集的病人唾液樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果見圖2,由圖可知7個(gè)唾液樣本均含有狂犬病病毒,各樣本實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Ct值分別為8號(hào):30.12,9號(hào):31.22,10號(hào):30.91,11號(hào)31.75,12號(hào):29.33,13號(hào):29.89:14號(hào)29.78。

        3 ?討 論

        本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)以一例真實(shí)發(fā)病的病人7個(gè)時(shí)段唾液及尿液為樣本進(jìn)行檢測(cè)。由結(jié)果可知尿液樣本中2號(hào)和6號(hào)樣本結(jié)果為陰性,其余時(shí)段尿液均有病毒檢出,而7個(gè)唾液樣本所有時(shí)均為陽性,且曲線的CT值明顯優(yōu)于尿液樣本。這是由于狂犬病的最主要傳染源是發(fā)病和攜帶病毒的動(dòng)物,這些動(dòng)物的唾液中含有大量病毒[5],并通過咬傷、抓傷進(jìn)行傳染,因此唾液樣本的病毒含量遠(yuǎn)高于尿液樣本。而狂犬病毒的分泌量由一定的波動(dòng)性[6],因此在尿液樣本中出現(xiàn)兩個(gè)陰性。

        目前,對(duì)狂犬病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、熒光抗體技術(shù)(FAT)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-TimePCR)等。目前FAT技術(shù)是WHO和OIE推薦的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法,但此方法需要異硫氰酸熒光素鹽為熒光標(biāo)記物標(biāo)記抗體以定位抗原,同時(shí)還需要使用熒光顯微鏡,操作較繁瑣,對(duì)試驗(yàn)操作人員專業(yè)素質(zhì)要求較高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其快速、靈敏、重復(fù)性好的特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于高通量的病毒檢測(cè),目前,國(guó)內(nèi)外已經(jīng)應(yīng)用這一技術(shù)建立了多種檢測(cè)RABV的熒光定量PCR方法,針對(duì)我國(guó)狂犬病的流行特征,許運(yùn)斌[7]等均成功合成引物和探針建立了熒光定量PCR檢測(cè)RABV的方法。但實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在試驗(yàn)過程中容易造成樣本的污染導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn),這一情況有待進(jìn)一步研究改善。

        狂犬病是一種嚴(yán)重危害人類生命安全的疫病,急需一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的診斷方法。本試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了一例人感染狂犬病病毒的尿液及唾液樣本,一定程度上填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)使用此方法用于臨床檢測(cè)報(bào)道的空白,對(duì)未來實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于臨床檢測(cè)人感染狂犬病病毒的檢測(cè)及推廣有一定的參考價(jià)值。

        參考文獻(xiàn)

        [1]Blanton J D,Palmer D,Dyer J,etal.Rabies surveillance in the United States during[J].J Am Vet Med Asso,2011,239:773~783.

        [2]王 科,葉 峰,趙英仁.狂犬病的研究進(jìn)展[J].臨床內(nèi)科雜志,2010,5(27):298~301.

        [3]Bourhy H,Tordo N,Kissi B.Molecular diversity of the Lyssa-virus genns[J]. Virology,1993,194:70~91.

        [4]高 鑫,朱武洋,盧學(xué)新.實(shí)時(shí)熒光定量PCR在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2018,34(7):660~666.

        [5]羅 明.我國(guó)狂犬病流行狀況分析及防治對(duì)策[J].中國(guó)人獸共患病雜志,2005,02.

        [6]Zaidman G W,Billingsley A.Corneal impression for the diagnosis of acute rabies encephatilis[J].Ophthalmology,1998,105(2):249~251.

        [7]許遠(yuǎn)斌,邵明富,范金紅,等.基因I型狂犬病毒一步熒光定量PT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2011,27(4):297~310.

        收稿日期:2018-12-7

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