席海瑞 盧大儒

各種遺傳病給人類社會帶來巨大困擾?；蛑委煆母拍钐岢龅脚R床應(yīng)用，遺傳病的基因冶療一直是研究重點(diǎn)。慢病毒和腺相關(guān)病毒在遺傳病的基因治療上獲得一定效果，但對更多遺傳病無可奈何，基因編輯工具的出現(xiàn)給遺傳病冶療帶來了新曙光，但在實(shí)際應(yīng)用中需要制定規(guī)范、達(dá)成國際共識，科學(xué)家必須受生物醫(yī)學(xué)倫理道德的約束。

遺傳病是由于遺傳物質(zhì)的改變，包括染色體畸變、染色體上基因突變，所導(dǎo)致的疾病，它完全或部分由遺傳因素決定，通常表現(xiàn)為先天性，也可由后天因素影響導(dǎo)致發(fā)生。遺傳病主要分為因染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)改變而引起的染色體病或染色體綜合征，如21三體綜合征（又稱唐氏綜合征）、貓叫綜合征等;單基因突變引起的單基因病，如β-地中海貧血癥、血友病等;多個基因突變引起的多基因病，如脊柱裂、無腦兒等遺傳病被發(fā)現(xiàn)之前，就已長期困擾著人類，特別是單基因遺傳病，已發(fā)現(xiàn)的單基因病有6500多種。雖然婚前檢查及孕后篩查可防止一部分遺傳病患兒出生，但是每年還是有相當(dāng)數(shù)量的患有遺傳疾病的嬰兒誕生，包括之前因無篩查條件而出生的人群，遺傳病給家庭及社會帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。治療遺傳病成為生物醫(yī)學(xué)科研人員的頭號難題。

基因治療的曙光與局限

從1950年代沃森和克里克證明遺傳物質(zhì)是DNA開始，科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)人類的很多疾病歸因于DNA層面出了問題，特別是各種各樣的遺傳病。1960年代，萊德伯格（J.Lederberg）提出基因治療的最初概念：利用正常的外源基因取代患者的變異基因。1970年代，科學(xué)家認(rèn)為遺傳病治療未來面對的主要問題是臨床基因治療，其主要難點(diǎn)是如何精確控制外源DNA進(jìn)入細(xì)胞，并正確進(jìn)入染色體上的確切位置而行使其功能。之后，科學(xué)家便投人大量精力研究遺傳病的基因治療，最初的研究策略是利用腺病毒、慢病毒及腺相關(guān)病毒，將正常外源基因?qū)嘶颊唧w內(nèi)。

1990年首例基因療法的臨床試驗(yàn)開始實(shí)施，四歲女孩德席爾瓦（A.DeSilva）患有重度聯(lián)合免疫缺陷?。╯evere combined immunodeficiency disease，SCID），由于患者體內(nèi)不能合成腺苷脫氨酶（A DA）導(dǎo)致缺乏正常的免疫力，科研人員從女孩體內(nèi)獲得自體白細(xì)胞，在體外利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將正確編碼腺苷脫氨酶的ADA基因插入女孩的白細(xì)胞基因組內(nèi)，再將感染慢病毒的白細(xì)胞重新回輸?shù)脚Ⅲw內(nèi)，之后女孩體內(nèi)的白細(xì)胞可以正常合成腺苷脫氨酶且免疫力顯著提高。此后，基因治療迎來爆發(fā)性的發(fā)展。但在1999年，18歲的美國男孩格爾辛格（J.Gelsinger）接受腺病毒載體注射進(jìn)行基因治療，導(dǎo)致多器官衰竭死亡，基因治療進(jìn)入了漫長的嚴(yán)冬期。直到2010年，基因治療才慢慢蘇醒：2012年歐盟審批通過了荷蘭UniQure公司生產(chǎn)的阿利潑金（glybera），該藥用于治療一種極其罕見的遺傳病——脂蛋白脂肪酶缺乏癥，使用一次就可顯著降低急性胰腺炎發(fā)病率，該藥是利用腺相關(guān)病毒作為載體，治療脂蛋白脂肪酶缺乏引起的嚴(yán)重肌肉疾病。2014年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）授予美國Celladon醫(yī)藥公司治療心衰的基因療法MYDICAR為“突破性療法”，這是FDA首次批準(zhǔn)的基因療法。該療法可重新激活人體內(nèi)的肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶2a（SERCA2a），改善心臟的泵血能力。

雖然基因治療獲得很多有前景的臨床結(jié)果，但仍存在一系列難題：一是將外源基因整合到目的細(xì)胞的基因組后，如何維持其穩(wěn)定表達(dá)，以及其對鄰近基因正常表達(dá)所產(chǎn)生的不可預(yù)測的影響;二是由于有些外源治療基因太大，不能通過現(xiàn)有載體進(jìn)入目的細(xì)胞內(nèi);三是外源基因的導(dǎo)人并不能直接解決顯性突變或去除突變，或插入遺傳物質(zhì)，如病毒基因組或細(xì)胞本身的受體。

基因編輯嶄露頭角

在科學(xué)家進(jìn)行傳統(tǒng)基因治療研究的同時，一種稱為“基因編輯”的技術(shù)開始嶄露頭角，并有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。由于基因編輯可對基因組序列進(jìn)行精確的有針對性的編輯，同時又具易用性、特異性和高效傳遞的優(yōu)點(diǎn)，從而為遺傳病的基因治療帶來了新思路和新希望。

基因編輯的原理是編輯工具制造靶向DNA雙鏈斷裂（double strand breaks，DSB），利用細(xì)胞內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制制造目的DNA的突變?nèi)笔?，或者將目的基因片段插入靶向DNA的位置。DNA斷裂后通常有兩種主要修復(fù)途徑：同源定向修復(fù)（homology directedrepair，HDR）和非同源末端連接修復(fù)（non-homologousend joining，NHEJ）。

HDR依賴于斷裂末端與外源基因的同源序列，以模板依賴方式修復(fù)斷裂。研究表明，通過在靶位點(diǎn)引入DNA雙鏈斷裂，可以刺激哺乳動物細(xì)胞中通過同源重組進(jìn)行基因打靶的效率上升幾個數(shù)量級。而NHEJ通過直接重新切割末端來修復(fù)DNA雙鏈斷裂，其中并無同源模板的參與，修復(fù)途徑容易出錯，且經(jīng)常導(dǎo)致在斷裂位點(diǎn)插入缺失。因此利用細(xì)胞內(nèi)源性DNA修復(fù)機(jī)制，可以在特定的基因位點(diǎn)處設(shè)計各種基因改變。但是基因編輯的關(guān)鍵是在基因的精確位置引入正確的DNA雙鏈斷裂。目前主流的誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性DNA雙鏈斷裂的工具有4種：鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs），大范圍核酸酶、CRISPR/Cas系統(tǒng)。其中由CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)展來的單堿基編輯系統(tǒng)為基因編輯帶來了新曙光。

鋅指核酸酶率先實(shí)現(xiàn)基因編輯

第一個用于基因編輯的酶是鋅指核酸酶，它由一個DNA識別域和一個非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成，DNA識別域是真核生物中最豐富的轉(zhuǎn)錄因子Cys2-His2（半胱氨酸、組氨酸）鋅指蛋白串聯(lián)組成，DNA剪切域是由海床黃桿M1 Fok I（細(xì)菌Flavobacteriumokeanokoites的type IIS限制酶）非特異性核酸內(nèi)切酶C端96個氨基酸殘基組成。

鋅指核酸酶只有在二聚體狀態(tài)時才有酶切活性，每個Fok I單體與一個鋅指蛋白相連構(gòu)成一個ZFN，識別DNA的特定位點(diǎn)，當(dāng)兩個識別位點(diǎn)相距6-8堿基對時，兩個單體ZFN相互作用產(chǎn)生酶切功能，誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂[1]。初步的實(shí)驗(yàn)表明，ZFN誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂可通過NHEJ或HDR的修復(fù)達(dá)到編輯基因組的目的，這已在非洲爪蟾、線蟲、果蠅及斑馬魚等進(jìn)行過實(shí)驗(yàn)，在外源同源基因存在的情況下，可對目的基因進(jìn)行10%～20%的正確修復(fù)，之后被用于成功修飾人體和多能干細(xì)胞的基因。

高效的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶編輯

2009年，首次應(yīng)用的TALENs為基因編輯開辟了新途徑。植物病原體黃單胞菌分泌轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（transcription activator-like effectors，TALES），該蛋白具有識別特異性DNA堿基對的功能，科學(xué)家結(jié)合其特異性提出了新型DNA結(jié)合蛋白模塊化設(shè)計可能性。TALENs的DNA結(jié)合性是由其高度保守的第3335位氨基酸以及高度可變的第12位和第13位氨基酸介導(dǎo)的。經(jīng)設(shè)計組成的模塊化的TALE單元重復(fù)連接起來，再與非特異性核酸內(nèi)切酶組合，從而建立具有定制DNA結(jié)合特異性的長陣列，該陣列結(jié)合到特定DNA位點(diǎn)，并由非特異性核酸內(nèi)切酶切斷DNA雙鏈，這就是TALENs。基于ZFN誘導(dǎo)基因組編輯10年來奠定的基礎(chǔ)，作為可編程DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，TALE很快就被TALENs工程化。與ZFN的工作原理一樣，TALE與Fok Ⅰ內(nèi)切核酸酶催化結(jié)構(gòu)域融合形成二聚體，切割預(yù)定的DNA靶位點(diǎn)[2]。TALENs的特異性切割活性已在酵母、擬南芥、水稻、果蠅及斑馬魚等多個動植物體系和體外培養(yǎng)細(xì)胞中得到驗(yàn)證，也被證明可有效誘導(dǎo)人源細(xì)胞及多能干細(xì)胞的NHEJ和HDR修復(fù)途徑。

除了ZFN和TALENs，還有大范圍核酸酶，大范圍核酸酶是內(nèi)切性脫氧核糖核酸酶，其最大特點(diǎn)是它在DNA中的工作識別位點(diǎn)較大——12～40個堿基對，因此被認(rèn)為是最特異的天然限制酶。在大范圍核酸酶中，最著名的是LAGLIDADG家族的歸巢核酸內(nèi)切酶，它是研究基因組最常用的工具之一，歸巢核酸內(nèi)切酶中最常用的是Ⅰ-CreI和Ⅰ-SceI酶[3]。許多研究表明，大范圍核酸酶在基因組編輯領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景，但是歸巢核酸內(nèi)切酶的DNA結(jié)合域和切割結(jié)構(gòu)域難以分離，對于新的蛋白質(zhì)的特異性設(shè)計相對困難的缺點(diǎn)限制了它的進(jìn)一步使用，主要應(yīng)用于科研中細(xì)胞和動物水平的基因編輯，但在基因編輯臨床治療中貢獻(xiàn)甚微。

更神奇的CRISPR/Cas編輯系統(tǒng)

在研究以上基因編輯工具的同時，科學(xué)家還在積極探索新的基因編輯工具。2002年荷蘭科學(xué)家揚(yáng)森（R.Jansen）通過對細(xì)菌和古細(xì)菌的研究，首次將細(xì)菌中已進(jìn)化為以抵御入侵質(zhì)粒和病毒基因組為目的的重復(fù)序列，命名為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR），并提出CRISPR-associated（Cas）的概念[4]。因?yàn)镃RⅠSPR具有切割外源基因的特性，所以科學(xué)家探索它是否可以作為應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中的基因編輯工具。

2012年美國科學(xué)家杜德納（J.Doudna）和卡彭蒂耶（E.Charpentier）首次發(fā)表CRⅠSPR/Cas系統(tǒng)的基因組編輯功能[5]。緊接著，2013年華人科學(xué)家張鋒首次證實(shí)CRISPR/Cas系統(tǒng)能編輯人細(xì)胞基因組[6]。由于其簡單便捷的操作性，CRISPR/Cas系統(tǒng)迅速席卷全球生物界。CRISPR系統(tǒng)的工作機(jī)制是：通過將入侵核酸的短序列整合到CRISPR基因座中，然后將它們轉(zhuǎn)錄并加工成CRISPR RNA（crRNA），并將其與反式激活的crRNAs（tracrRNAs）一起，與CRISPR相關(guān)Cas蛋白復(fù)合，通過核酸之間的堿基配對，執(zhí)行Cas核酸酶對DNA的特異性切割，通過NHEJ和HDR兩條修復(fù)途徑，完成基因編輯。

研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型CRISPR核酸酶最主要的三種成分是Cas9蛋白、成熟crRNA和tracrRNA。2012年杜德納、卡彭蒂耶及其同事通過將crRNA和tracrRNA融合成單一向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA），而將該系統(tǒng)簡化為兩個組分，大大提高了CRISPR/Cas的使用便捷性[5]。這樣，只要根據(jù)目的序列合成特定的sgRNA，使其與Cas9在目的細(xì)胞內(nèi)共同表達(dá)，即可進(jìn)行特異性基因編輯。與之前三種核酸酶系統(tǒng)不同，CRISPR/Cas9核酸酶不需要為每個DNA靶位點(diǎn)設(shè)計新蛋白質(zhì)，它通過改變決定特異性的gRNA短區(qū)域，可相對容易地靶向目的位點(diǎn)，從而使該系統(tǒng)成為引入位點(diǎn)特異性DSB的極具吸引力的方法此后CRISPR/Cas9系統(tǒng)被迅速廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，成為基因組編輯領(lǐng)域的最大熱點(diǎn)。

單堿基編輯：從基因手術(shù)刀到基因筆

單堿基編輯器是2016年華人科學(xué)家劉戴維（D.R.Liu）首先發(fā)明的一種新興的基因組DNA點(diǎn)突變特定修復(fù)體系，它依賴于招募胞苷脫氨酶引入單堿基變化（不是雙鏈斷裂和供體模板），提高了潛在的效率，同時降低了DNA雙鏈斷裂引起的不必要的DNA損傷，簡化了基因編輯的過程[7]。

劉戴維的開創(chuàng)性工作——堿基編輯器（baseeditor，BE）系統(tǒng)一經(jīng)發(fā)表，就在不斷升級版本?，F(xiàn)在最常用的有兩套系統(tǒng)：CBE系統(tǒng)，能特異性地將C突變?yōu)門;ABE系統(tǒng)，能特異性地將A突變?yōu)镚} CBE系統(tǒng)包括sgRNA和融合蛋白，融合蛋自由改造的nCas9蛋自（Cas9蛋白的第10位天冬氨酸突變?yōu)楸彼幔⒋笫髞碓吹陌奏っ摪泵福╝polipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like protein，APOBECI）和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑（uracilDNA glycosylase inhibitor，UGI）三部分組成。當(dāng)sgRNA與融合蛋白結(jié)合并引導(dǎo)至目的的DNA序列互補(bǔ)配對、nCas9對目的DNA序列進(jìn)行單鏈切割，APOBECI將非互補(bǔ)鏈中相應(yīng)的C經(jīng)脫氨基作用轉(zhuǎn)變?yōu)閁，UGI維持U的狀態(tài)，DNA復(fù)制進(jìn)一步使得U被T代替，從而完成C到T的突變[7]。

ABE系統(tǒng)也包括sgRNA與融合蛋白，融合蛋白由nCas9蛋白、野生型tRNA腺嘌呤脫氨酶（TadA）和突變型tRNA腺嘌呤脫氨酶（TadA*）組成。當(dāng)sgRNA與融合蛋白結(jié)合并引導(dǎo)至目的的DNA序列互補(bǔ)配對，nCas9對目的DNA序列進(jìn)行單鏈切割，TadA與TadA*將非互補(bǔ)鏈中相應(yīng)的腺嘌呤A經(jīng)脫氨基作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤（I），DNA復(fù)制進(jìn)一步使得I被G代替，從而完成A到G的突變[8]。

單堿基編輯系統(tǒng)一經(jīng)出現(xiàn)就廣受好評，又經(jīng)過對脫氨酶和Cas9類型的改造，目前已制造出各種類型的單堿基編輯系統(tǒng)，大大提高了其應(yīng)用性。該系統(tǒng)已被應(yīng)用于小麥、人類胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞及小鼠活體水平。相比普通CRISPR/Cas系統(tǒng)，它具有較低的脫靶率，雖然還有相應(yīng)的效率穩(wěn)定性問題和未知的安全性，但科學(xué)家還是將其視為適用于治療遺傳病的更好的基因編輯工具。2017年美國科學(xué)家利用單堿基編輯系統(tǒng)成功地將小鼠PSCK9基因引入位點(diǎn)特異性無義突變，導(dǎo)致成年小鼠血漿中PCSK9蛋白降低50%同時及血漿膽固醇水平降低約30%。[9]2017年我國科學(xué)家黃行許和劉見橋利用該系統(tǒng)在人胚胎細(xì)胞中進(jìn)行了首次實(shí)驗(yàn)，獲得目的單堿基突變的同時，也檢測了單堿基編輯可能帶來的脫靶效率[10]。

基因編輯大顯身手

在五種基因編輯平臺出現(xiàn)之后，CRISPR/Cas系統(tǒng)的操作簡易性和應(yīng)用廣泛性，被大多數(shù)科學(xué)家認(rèn)為是最有前途和可能最快投入實(shí)際應(yīng)用的方法。但現(xiàn)實(shí)情況卻不是這樣，雖然鋅指核酸酶的操作復(fù)雜，但它可定位的序列更長，進(jìn)行基因編輯的精準(zhǔn)度也更高，從而成為美國FDA首個批準(zhǔn)用于人體臨床試驗(yàn)的基因編輯平臺。2017年美國圣加蒙公司（Sangamo Therapeutics）對患有亨特綜合征的44歲男子B.Madeux進(jìn)行了代號為“SB-913”的首例人體基因編輯治療。

亨特綜合征是一種罕見遺傳病，患者主要是男性，每10萬個至17萬個新生男嬰中會有一位不幸罹患此病。亨特綜合征患者體內(nèi)缺少IDS基因，該基因的功能是生成一種可分解有毒碳水化合物的酶，IDS基因缺失會導(dǎo)致扮演“清潔I="角色的酶缺位，從而造成細(xì)胞內(nèi)累積有毒代謝物，給患者的器官帶來毀滅性打擊。由腺相關(guān)病毒、鋅指核酸酶和IDS基因三部分組成的SB-913治療藥物進(jìn)入人體后，腺相關(guān)病毒作為載體，攜帶鋅指核酸酶和正常IDS基因直達(dá)人體肝細(xì)胞，肝細(xì)胞通過天生的DNA修復(fù)機(jī)制，可以把正常IDS基因插入染色體上的相應(yīng)位點(diǎn).完成目的細(xì)胞的基因編輯治療。

2016年，美國賓夕法尼亞大學(xué)計劃在人體上開始CRISPR研究，計劃得到美國國立衛(wèi)生研究院和FDA的許可——用CRISPR技術(shù)治療黑色素瘤、肉瘤和多發(fā)性骨髓瘤。試驗(yàn)包括移除患者的T細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)室中將其編輯后，再注人患者體內(nèi)。2018年，瑞士基因編譯公司（CRISPR Therapeutics）成為首家獲得歐洲監(jiān)管機(jī)構(gòu)許可開展臨床基因治療的公司.他們利用基因編輯技術(shù)來修復(fù)地中海貧血癥患者的基因缺陷，先從患者骨髓中提取干細(xì)胞，然后用CRISPR進(jìn)行基因編輯，同時重組進(jìn)正常血紅蛋白的基因，治愈地中海貧血癥。斯坦福大學(xué)的研究人員計劃通過直接糾正患者十幾細(xì)胞中血紅蛋白基因的突變，將有缺陷的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為正常細(xì)胞二但是.有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，人與人之間的基因差異可能會削弱CRISPR/Cas基因編輯的有效性，也可能會導(dǎo)致十分危險的脫靶效應(yīng)，這使得CRISPR/Cas的臨床之路蒙上了新陰影。

2018年11月26日中國賀建奎宣布了一對首例免疫艾滋病的基因編輯嬰兒誕生，消息震驚了國際科學(xué)界和醫(yī)學(xué)界人自細(xì)胞表面有一種CCR5基因是表達(dá)的蛋白質(zhì)，RS型艾滋病病毒（HIV）借助CCR5蛋白進(jìn)人并感染宿主細(xì)胞，致人患病。然而，自然人群中有一定比例的人，其CCR5基因因有32對堿基的缺失，導(dǎo)致表達(dá)的CCR5-Δ32蛋白無法被R5型HIV病毒識別和結(jié)合，從而使這些人不會得艾滋病。

賀建奎招募了8對男方HIV陽性、女方HIV陰性的志愿者夫婦，在體外受精的受精卵中注射了Cas9蛋自和針對CCR5基因的sgRNA，體外培養(yǎng)至囊胚進(jìn)行基因診斷，之后將兩個胚胎移植進(jìn)母親子宮中，最終誕生從出生其CCR5基因就被敲除的雙胞胎嬰兒，宣稱該對嬰兒對R5HIV免疫但是，實(shí)驗(yàn)室CRISPR/Cas9技術(shù)編輯敲除的CCR5基因的功能與人群中自然產(chǎn)生的CCR5基因突變?nèi)毕莸墓δ苁欠褚恢?，尚未可?且人群中的CCR5基因突變?nèi)毕荩瑫?dǎo)致攜帶者在感染西尼羅河病毒后，出現(xiàn)更嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病;同時，賀建奎只是從測序角度回應(yīng)CRISPR/Cas9對于CCR5基因編輯在嬰兒體內(nèi)沒有出現(xiàn)脫靶效應(yīng)、并聲稱嬰兒的CCR5基因并沒有編輯為CCR5-032，所以嬰兒中CCR5的突變表型未知，孩子們未來的風(fēng)險也是未知的。

該事件報道后，100多名中國科學(xué)工作者迅速發(fā)表聯(lián)合簽署的聲明進(jìn)行強(qiáng)烈譴責(zé)：該實(shí)驗(yàn)技術(shù)[_毫無創(chuàng)新，嚴(yán)重違背國家的相關(guān)生命倫理規(guī)范準(zhǔn)則，突破了科學(xué)家的倫理道德底線國家相關(guān)監(jiān)管部門和國際醫(yī)學(xué)專家們亦對此表示憤怒和譴責(zé)基因編輯嬰兒事件對于基因編輯的疾病治療帶來了巨大的負(fù)面影響，同時也重創(chuàng)了從事基因編輯研究的中國科學(xué)家的聲譽(yù)。

隨著科學(xué)家的不斷努力，已有基因編輯系統(tǒng)的持續(xù)開發(fā)和優(yōu)化不僅在細(xì)胞和動物水平，也會在人類遺傳疾病治療中獲得新成果但無論TALENs還是CRISPR/Cas系統(tǒng)，在正式商業(yè)化地應(yīng)用于人類遺傳病治療之前，還有很長遠(yuǎn)的路要走.已有的技術(shù)和未來發(fā)明的基因編輯工具將為遺傳病治療提供新的可能與思路。但是基因編輯嬰兒事件也給我們一個警示，基因編輯應(yīng)用于疾病治療的過程中生物醫(yī)學(xué)倫理底線絕對不容被踐踏。

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關(guān)鍵詞：遺傳病 基因編輯 基因治療 基因倫理