崔佳文 周佳海

2018年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予美國加州理工學(xué)院教授阿諾德密蘇里大學(xué)教授史密斯和英國醫(yī)字研究理事會(huì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室教授溫特.以表彰他們?cè)凇懊付ㄏ蜻M(jìn)化”和“肽和抗體噬菌體展示”方面的貢獻(xiàn)。

2018年10月3日，2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)揭曉。美國加州理工學(xué)院化學(xué)工程系教授阿諾德（F.H.Arnold）獲得一半獎(jiǎng)金，以表彰她在“酶定向進(jìn)化”方面的貢獻(xiàn);另一半獎(jiǎng)金授予美國密蘇里大學(xué)教授史密斯（G.P.Smith）和英國醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室教授溫特（G.P.Winter）爵士，以表彰他們?cè)凇半暮涂贵w噬菌體展示”方面的貢獻(xiàn)。

酶和酶的定向進(jìn)化

阿諾德是諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)史上第5位獲獎(jiǎng)女性，之前4位女性是居里夫人（1911年）、居里夫人的女兒伊雷娜（Irene Joliot-Curie，1935年）、霍奇金（D.C.Hodgkin，1964年）和尤納特（A.Yonath，2009年）阿諾德出生在一個(gè)核物理學(xué)家的家庭，受父親的影響，本科就讀于普林斯頓大學(xué)的機(jī)械工程和航天工程專業(yè)，博士階段選擇的是化學(xué)工程，然后轉(zhuǎn)向生物工程。她的哥哥很早就是大學(xué)的病毒學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)教授，在她早期的成長道路上給予她許多幫助。

酶是一類大分子生物催化劑，目前已知的酶可催化超過5 000種生化反應(yīng)。大部分的酶是蛋白質(zhì)，少部分的酶是具有催化活性的RNA分子（這些酶被稱作核酶）。與所有催化劑一樣，酶通過降低反應(yīng)活化能加快化學(xué)反應(yīng)的速率。酶和其他催化劑的不同之處在于，它們的專一性要強(qiáng)得多幾乎所有細(xì)胞內(nèi)的代謝過程都離不開酶。酶能大大加快這些過程中各化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的速率，使代謝產(chǎn)生的物質(zhì)和能量滿足生物體的需求然而，一旦脫離了細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，溫度、酸堿度、鹽濃度、有機(jī)溶劑等外在條件會(huì)極大程度地影響酶的穩(wěn)定性、催化活性以及選擇性，在體外，酶常常無法發(fā)揮其原本的性能此外，酶催化的專一性也往往決定了它作用的底物單一，難以拓展應(yīng)用到其他非天然底物中為攻克這些弊端，酶的定向進(jìn)化就成了必要的手段。

阿諾德從自然界的進(jìn)化規(guī)律中找到靈感，率先使用定向進(jìn)化技術(shù)來改造酶（這里僅指用作催化的蛋白質(zhì)，不包括核酶）。她和來自中國的陳克勤博士為突破如何找到高效率方法來改變并篩選出適合特定工業(yè)環(huán)境下、具有催化活性的酶這一瓶頸問題，大膽地采用隨機(jī)突變策略，通過引入突變并連續(xù)提高篩選壓力獲得具有多個(gè)突變組合的酶，這些酶能快速適應(yīng)從來沒有接觸過的工業(yè)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)獲得了十分滿意的結(jié)果[1，2]。他們從一種存在于白然界的枯草桿菌蛋白酶著手研究，率先將其編碼基因進(jìn)行隨機(jī)突變，產(chǎn)生出多種存在著些許差異的枯草桿菌蛋白酶突變體庫，然后分別檢測(cè)它們?cè)谟袡C(jī)溶劑中的酶活性，從中篩選出活性最高的酶;隨后針對(duì)第一輪得到的酶，再進(jìn)行更多輪次的進(jìn)化篩選，直到找出符合預(yù)期的活性最高的酶。在第三代枯草桿菌蛋白酶中，他們發(fā)現(xiàn)一種突變體溶解在60%二甲基甲酰胺中的催化效率比野生型酶高出256倍，這種活性水平與野生型酶在水溶液中的活性水平相當(dāng)?；诖耍⒅Z德提出了“定向進(jìn)化”這一概念，即通過一定程度地模擬自然進(jìn)化與選擇的過程，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)引入有益突變，從而改造蛋白質(zhì)的功能[2]。

1998年，阿諾德和來自中國的博士生趙惠民發(fā)明了交錯(cuò)延伸技術(shù)t31通過在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR）中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步，并大大縮短其反應(yīng)時(shí)間，達(dá)到了變換模板和交錯(cuò)延伸的目的。該法簡便且有效，為酶的體外定向進(jìn)化提供了又一強(qiáng)有力的工具、阿諾德和其他科學(xué)家通過定向進(jìn)化提高了多種酶的催化活性、熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性、對(duì)底物的立體選擇性，甚至還能夠創(chuàng)造出催化原本自然界中并不存在反應(yīng)的新型酶。

酶定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)的順利開展，離不開酶突變體的產(chǎn)生、多樣化組合和高效篩選。首先，在編碼酶的基因水平上，盡可能多地人為造成隨機(jī)突變或重組，形成一個(gè)龐大的基因突變庫，然后再表達(dá)出相應(yīng)的酶蛋白突變體庫。隨后在人工模擬的惡劣環(huán)境或要求下（如高溫、高毒性），從庫中定向篩選出具理想性狀的蛋自突變體（如高活性、高選擇性、高穩(wěn)定性等）。最后，從選出的突變體中提取其基因作為母本，建立下一輪的酶基因突變庫，實(shí)現(xiàn)酶的進(jìn)化。

提到酶突變體的多樣化組合技術(shù)，有一個(gè)人不得不提及。他就是已故的施特默爾（W.P.C.Stemmer）博士，他在1994年發(fā)展了一項(xiàng)新的基因改組（DNAshuflling）技術(shù)，讓基因可以在試管里重新“洗牌”[4]。這種技術(shù)首先通過核酸酶將單個(gè)或一組基因隨機(jī)打斷，再通過基因擴(kuò)增將它們連接起來，由于部分基因具有同源性，碎片基因可以實(shí)現(xiàn)錯(cuò)配雜交，當(dāng)A基因和B基因連接在一起時(shí)，會(huì)形成新的組合，可高效地產(chǎn)生多樣性的酶突變體庫。如果把基因比喻成各種花色和數(shù)字的撲克牌，隨機(jī)點(diǎn)突變就像是某一張或若干張撲克牌隨機(jī)發(fā)生了改變，比如紅桃7變成梅花K，小王變成了大王。而基因改組技術(shù)，則像是拿出不同的牌面洗到一起，由此得到了更豐富的多樣性，也更有可能較快產(chǎn)生擁有優(yōu)良性能的酶。同年，施特默爾利用該技術(shù)對(duì)階內(nèi)酞胺酶成功地進(jìn)行了改組，經(jīng)過3輪改組和兩輪同野生型DNA的回交，去除了負(fù)突變，篩選到最低抑制濃度的突變子，其活性水平是野生型的32000倍[5]。

酶定向進(jìn)化領(lǐng)域的另一位奠基人是德國科學(xué)院院士、上海有機(jī)化學(xué)研究所名譽(yù)教授雷茨（M.T.Reeetz），他于1997年首次將定向進(jìn)化的概念和方法應(yīng)用于對(duì)酶的手性改造，并引入到有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，用于不對(duì)稱催化合成，創(chuàng)立了用于酶立體選擇性改造的組合活性中心飽和突變[6]和迭代飽和突變技術(shù)[7]，通過對(duì)定向進(jìn)化的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和模型設(shè)計(jì)，成功地實(shí)現(xiàn)了將龐大的酶突變體庫縮小到1000個(gè)以內(nèi)，使定向進(jìn)化的工作開展得更便捷高效。為此，在第九屆國際生物催化大會(huì)上，他被授予“2018生物催化獎(jiǎng)終身成就獎(jiǎng)”。

噬菌體展示技木

史密斯的貢獻(xiàn)在于發(fā)明了一種名為“噬菌體展示”的新技術(shù)。他將特定蛋白質(zhì)或多肽的遺傳密碼人工插入到編碼噬菌體外殼蛋白基因的適當(dāng)位置，使外源蛋白質(zhì)或多肽隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，它們隨噬菌體的重新組裝而被展示到噬菌體表面[8]。該展示技術(shù)第一次把蛋白質(zhì)和對(duì)應(yīng)的基因在一個(gè)極其簡單的系統(tǒng)里直接建立了聯(lián)系，解決了之前分子生物學(xué)家最為頭痛的問題之一。這些展示的噬菌體可以對(duì)其他蛋自質(zhì)、多肽或者DNA序列一起進(jìn)行識(shí)別和篩選，從而檢測(cè)展示的蛋白質(zhì)與其他分子間的相互作用。在此基礎(chǔ)上所發(fā)展而來的噬菌體展示克隆技術(shù)可應(yīng)用于活性天然產(chǎn)物（如中藥的有效組分）的靶標(biāo)鑒定。

溫特利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行抗體的定向進(jìn)化，其目的是產(chǎn)生新的藥物[9]?？贵w的生產(chǎn)一般是用抗原免疫動(dòng)物而得到，這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本高昂，此外如果用作藥物，動(dòng)物產(chǎn)生的抗體輸入人體會(huì)被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別為外來抗原而迅速被消滅掉。噬菌體展示技術(shù)能幫助生產(chǎn)可中和毒性物質(zhì)、對(duì)抗自身免疫疾病的抗體，甚至治愈轉(zhuǎn)移性腫瘤，如今許多暢銷藥品問世都有它們的功勞。溫特采用這項(xiàng)技術(shù)制造的第一種藥物“阿達(dá)木單抗”在2002年被正式批準(zhǔn)，用于對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬以及炎癥性腸道疾病的治療。其注射液“修美樂”連續(xù)6年成為全球“藥王”，2017年貢獻(xiàn)了184.27億美元營收。2017年6月，“修美樂”在中國又獲批用于治療新的適應(yīng)癥銀屑?。ㄋ追Q牛皮癬），成為中國首個(gè)用于治療成年中重度慢性斑塊型銀屑病的全人源抗腫瘤壞死因子-α單克隆抗體。噬菌體展示技術(shù)正被大量用于抗體藥物的研發(fā)，目前已上市的抗體藥物中有近十種得益于該技術(shù)的研發(fā)。

人工進(jìn)化的愿景

酶定向進(jìn)化技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)能在實(shí)驗(yàn)室中模擬自然界進(jìn)化，采用這些技術(shù)，人們可以在體外大大加快生物進(jìn)化的速度，創(chuàng)造出一系列具重要商業(yè)價(jià)值的基因和蛋白質(zhì)，將會(huì)對(duì)人們生活的各個(gè)領(lǐng)域產(chǎn)生革命性的影響。定向進(jìn)化技術(shù)為酶的改造提供了一種全新策略，經(jīng)過這種方法篩選到的酶能夠突破天然酶的諸多限制，大大拓展了應(yīng)用范圍。定向進(jìn)化不僅可針對(duì)單一的酶進(jìn)行，還可對(duì)一些重要天然產(chǎn)物的生物合成途徑中的不同酶，同時(shí)進(jìn)行改造和優(yōu)化。目前基于定向進(jìn)化技術(shù)獲得的酶，已在藥品制造、可再生能源、環(huán)保行業(yè)等方面得到廣泛應(yīng)用，極大地推動(dòng)了人類的綠色化學(xué)發(fā)展。

在阿諾德的課題組里曾經(jīng)有許多華人科學(xué)家的身影，他們做出了許多開創(chuàng)性的貢獻(xiàn)，比如前面提到的陳克勤、趙惠民，還有現(xiàn)在杜克大學(xué)生物醫(yī)藥工程系任教授的游凌沖、華南理工大學(xué)生物和生物工程學(xué)院的林章凜教授等。他們利用酶定向進(jìn)化技術(shù)在合成生物學(xué)、代謝工程、生物催化、生物制藥等領(lǐng)域都做出了杰出貢獻(xiàn)。

[1]Chen K，Arnold F H.Enzyme engineering for nonaqueous solvents：random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organicmedia.Bio/Technol（N Y），1991，9（11）：1073-1077.

[2]Chen K，Arnold F H.Tuning the activity of an enzyme for unusualenvironments：sequential random mutagenesis of subtilisin E forcatalysis in dimethylformamide.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90（12）：5618-5622.

[3]Zhao H，Giver L，Shao Z，et al.Molecular evolution by staggeredextension process（StEP） in vitro recombination.Nat Biotechnol，1998，16（3）：258-261.

[4]Stemmer W P.DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：in vitro recombination far molecular evolution.Proe Natl Acad SciUSA，1994，91（22）：10747-10751.

[5]Stemmer W P.Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling.Nature。1994，370（6488）：389-391.

[6]Reetz M T，Bocola M，Carballeira J D，et al.Expanding the range ofsubstrate acceptance of enzymes：combinatorial active-site saturationtest.Angew Chem Int Ed，2005，44（27）：4192-4196.

[7]Reetz M T，Carballeira J D.Iterative saturation mutagenesis（ISM） forrapid directed evolution of functional enzymes.Nat Protoc，2007，2：891-903.

[8]Smith G P.Filamentous fusion phage：novel expression vectors thatdisplay cloned antigens on the virion surface.Science，1985，228（4705）：1315-1317

[9]McCafferty J，Griffiths A D，Winter G，et al.Phage antibodies：filamentous phage displaying antibody variable domains.Nature，1990，34&（6301）：552-554.

關(guān)鍵詞：定向進(jìn)化 酶工程 噬菌體展示 抗體藥物