羅怡琳 蒙正群 周麗軍 王印 姚學(xué)萍 楊澤曉 羅燕 耿毅

摘要：采用胰酶消化法培養(yǎng)技術(shù)，對乳兔脾臟組織的細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，從脾臟組織中分離出1株成纖維型細(xì)胞，命名為RS-17。通過對細(xì)胞傳代培養(yǎng)條件優(yōu)化，細(xì)胞標(biāo)志性蛋白檢測，細(xì)胞生長曲線分析，細(xì)胞核型以及細(xì)胞致瘤性等測定，結(jié)果顯示，RS-17細(xì)胞具有血清依懶性，成纖維細(xì)胞標(biāo)志性蛋白檢測陽性，具有正常的核型，無致瘤性，且目前細(xì)胞傳至95代仍可穩(wěn)定生長。這為RHDV（兔出血癥病毒）感染機(jī)制等相關(guān)研究提供了細(xì)胞材料。

關(guān)鍵詞：乳兔;脾臟組織;細(xì)胞系;生物學(xué)特性;

中圖分類號：$829.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-4440（2019）01-0130-06

家兔是具有重要毛用和肉用價值的傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)動物，在中國畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位。兔也是傳統(tǒng)的試驗?zāi)Ｊ絼游?，與小鼠、猴、豬等試驗動物相比，體型適中，易操作，且生理結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制與人類接近，尤其適用于人類心腦血管疾病等研究。

RHDv（兔出血癥病毒）從爆發(fā)以來，國內(nèi)外學(xué)者相繼對該病毒開展了深入研究，在病原學(xué)、診斷技術(shù)、免疫防控等多方面取得了卓越的進(jìn)展。但有一個很棘手的問題就是目前對于該病毒尚無穩(wěn)定的培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)，國內(nèi)外的研究者曾用60余種動物的原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞培養(yǎng)RHDv，但是均未獲得成功。RHDv培養(yǎng)細(xì)胞系的缺乏影響著RHDv的細(xì)胞侵染機(jī)理和防控等方面的研究，所以探尋出1株合適的細(xì)胞系會是研究RHDV侵染機(jī)制以及防控該病的重要突破。近年來，隨著細(xì)胞生物學(xué)以及腫瘤的大量研究，永生化細(xì)胞因為有著培養(yǎng)的均一性、穩(wěn)定性和操作簡便性等一系列的優(yōu)點逐漸進(jìn)入人們視野。本研究偶然獲得1株可穩(wěn)定傳代的兔脾臟成纖維型細(xì)胞，對其培養(yǎng)以及建系，為RHDV的侵染研究提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1動物

2日齡乳兔，25g 6周齡Balb/c小鼠購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司。

1.2主要試劑

干粉DMEM、胎牛血清（FBs）購自Gibco公司，胰酶、曲拉通x-100透化液、Hoechst33342購于索萊寶公司，青霉素、鏈霉素、碳酸氫鈉、氯化鉀、氯化鈉、牛血清白蛋白BSA等購自博大萬科有限公司，MTT細(xì)胞增殖試劑盒、吉姆薩染色液、秋水仙素購自生工生物工程（上海）股份有限公司，波形蛋白一抗購自武漢博士德公司，角蛋白一抗購自Novus公司，羊抗鼠Alexa Fluor 488二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.5乳兔脾臟原代細(xì)胞的培養(yǎng)

原代細(xì)胞培養(yǎng)采用酶消化法，在超凈工作臺處死乳兔，并在75%酒精中浸泡1～5 min，在無菌條件下取出脾臟，放置于裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿中涮洗，盡量除去組織的血液，轉(zhuǎn)移到有濾網(wǎng)的無菌培養(yǎng)皿，在濾網(wǎng)上用剪刀剪碎組織，加入適量0.25%胰酶消化，用完全培養(yǎng)液進(jìn)行沖洗，將液體全部吸入15ml離心管中，放置10 min使大的組織塊自然沉降，然后將上層培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至底面積為25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于5%cO，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞貼壁情況以及生長狀態(tài)更換培養(yǎng)液，選擇生長狀態(tài)穩(wěn)定的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.6乳兔脾臟細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%～90%時，棄掉培養(yǎng)液，用PBS液清洗3次，加入胰酶消化，在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓時，加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行終止，輕微吹打使細(xì)胞完全從壁上脫離，按1：2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀況以及形態(tài)，選取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，每傳2代保存一批細(xì)胞。在乳兔脾臟細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)的過程中，發(fā)現(xiàn)1株生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)至八代時細(xì)胞生長緩慢，將細(xì)胞傳代轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞繼續(xù)生長，且生長速度加快，將該細(xì)胞株命名為RS-17，并對細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

3討論

長期以來，永生化細(xì)胞的建立主要運用于攻克動物疾病研究以及人類醫(yī)學(xué)上的相關(guān)難題。輻射以及病毒轉(zhuǎn)染會促使永生的細(xì)胞在生長特性以及生物學(xué)特性上都會有所改變，而通過端粒酶轉(zhuǎn)染的細(xì)胞保持著正常細(xì)胞的特點，所以近20年通過端粒酶建立了大量的人類器官的永生化細(xì)胞，如人的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。同時，大量的動物永生化細(xì)胞也通過該方法進(jìn)行建立，veitonmaki等將hrrERT轉(zhuǎn)入牛毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞，將細(xì)胞內(nèi)源性的p16INK4a/p Rb滅活，而使細(xì)胞發(fā)生永生化。洪海霞等、蘇正元等通過轉(zhuǎn)染hTERT質(zhì)粒構(gòu)建了豬的血管內(nèi)皮細(xì)胞。本研究中的細(xì)胞在培養(yǎng)至8代后，細(xì)胞在14 d內(nèi)基本停止增殖，當(dāng)把細(xì)胞通過胰酶消化轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶時，細(xì)胞開始生長，且生長速度加快，生長能力以及形態(tài)隨著細(xì)胞的繼續(xù)傳代未有明顯改變。而培養(yǎng)了幾批次的原代細(xì)胞都在傳至7～9代就開始生長緩慢，傳至10～11代細(xì)胞停止生長開始脫落。目前RS-17細(xì)胞已傳至95代仍形態(tài)穩(wěn)定，完全超過了細(xì)胞正常的生長周期以及傳代次數(shù)，說明RS-17細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過程中經(jīng)過自發(fā)或外界因素的影響從增殖衰老危機(jī)中逃離而達(dá)到了永生化。嚙齒類動物細(xì)胞自發(fā)永生化的幾率為10-610-5、0～10-6，這不是第1個乳兔細(xì)胞在自然狀態(tài)下達(dá)到永生化的案例，1992年，吉傳義等在培養(yǎng)乳兔腎原代細(xì)胞的過程中，也偶然獲得了1株轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞系。

RS-17細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，貼壁后前期細(xì)胞密度小，細(xì)胞多為突起的紡錘形以及扁平星形，后期細(xì)胞增殖變多后形態(tài)主要為梭形，根據(jù)形態(tài)可初步認(rèn)定其為成纖維型細(xì)胞，進(jìn)行免疫熒光染色顯示細(xì)胞波形蛋白陽性，參照相關(guān)研究結(jié)果，鑒定該細(xì)胞屬于成纖維型細(xì)胞。在細(xì)胞生長曲線測定中，可見隨著細(xì)胞增殖密度加大，有細(xì)胞脫落死亡，同時細(xì)胞無重疊生長狀態(tài)出現(xiàn).顯示細(xì)胞具有正常的生長特性，且具有接觸抑制性，MTI檢測血清依賴性試驗中，3%的血清培養(yǎng)基相對于無血清培養(yǎng)基有著極顯著的促進(jìn)生長作用，而與5%、10%的血清培養(yǎng)基之間促進(jìn)作用無顯著差異，說明3%、5%血清培養(yǎng)基可以作為RS-17細(xì)胞的培養(yǎng)基：核型觀察細(xì)胞染色體為44條，這與家兔的染色體條數(shù)一致，且選取了2個傳代次數(shù)的細(xì)胞，在染色體數(shù)目上沒有明顯變化，說明RS-17細(xì)胞具有正常的染色體，細(xì)胞在注射小鼠后沒有體現(xiàn)出致瘤性。以上試驗結(jié)果表明該細(xì)胞已經(jīng)建系成功，為后續(xù)RHDV侵染相關(guān)研究提供了科學(xué)材料。