李隱俠 張俊 錢勇 孟春花 王慧利 曹少先 仲躋峰

摘要：以江蘇特色綿羊品種——湖羊為研究對象，克隆湖羊NR5A1基因全序列，分析其序列特征，并對湖羊組織和大、小卵泡中NRSAJ表達特征進行研究。結果表明，湖羊NRSAJ基因全長19 016 bp，含6個外顯子和5個內(nèi)含子;編碼區(qū)全長1 386 bp，編碼461個氨基酸殘基，包含經(jīng)典的DNA結合區(qū)（DBD）和配體結合區(qū)（IJBD）。RT-PcR結果顯示NR5A1基因在湖羊組織中廣泛表達，其中在卵巢中高表達，脾臟次之;qRT-PcR和westem b10t結果顯示在湖羊大卵泡中NR5A1 mRNA和蛋白質水平均顯著高于小卵泡，表明NRSA1基因參與調控湖羊卵泡發(fā)育，并與繁殖性能有關。

關鍵詞：湖羊;NR5A1基因;序列特征;表達

中圖分類號：s826.3 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4440（2019）01-0114-08

羊NR5A1基因的研究較少，僅本實驗室前期在湖羊上進行了NR5A1基因多態(tài)性的篩選和鑒定，結果表明NR5A1內(nèi)含子區(qū)多態(tài)性可以作為分子標記篩選高繁殖力綿羊，但是對于湖羊NR5A1基因序列特征、組織表達模式及其在卵泡中表達的研究并未涉及。本研究以湖羊為研究對象，通過PCR擴增和克隆測序方法克隆湖羊NR5A1基因全序列，分析其序列特征，鑒別其組織表達模式及其在湖羊不同級別卵泡中表達差異，以期更全面了解NR5A1基因，為更詳盡探索其參與調控湖羊繁殖性能的分子機制提供一定的理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

從江蘇省蘇州市東山湖羊資源保種區(qū)挑選純種湖羊母羊，屠宰后取其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、卵巢、子宮和肌肉組織于液氮中保存帶回實驗室，于70℃冰箱保存，提取DNA、RNA和蛋白質用于后續(xù)試驗。用手術剪分離卵巢中卵泡，得到大卵泡（直徑>5 mm）和小卵泡（直徑<3 mm），于液氮中保存，提取RNA和蛋白質用于后續(xù)試驗。

1.2 DNA和RNA的提取

全基因組DNA提取采用傳統(tǒng)的苯酚一氯仿方法，RNA提取用RNA提取試劑盒（Bioteke，北京）。瓊脂糖凝膠和Nandrop方法測定DNA和RNA完整性和濃度。

2.4湖羊NRSAl基因組織表達模式mRNA水平與湖羊繁殖性能的相關性

用RT-PCR方法檢測NR5A1基因在湖羊10個組織中的表達模式，發(fā)現(xiàn)NR5A1基因在湖羊各個組織中均有表達，但是在卵巢組織中表達量最高，腎臟次之，其他組織中均低表達，肝臟組織中表達量最低（圖5）。

2.5 NRSAl基因對湖羊卵泡發(fā)育的調控

用qRT-PCR方法檢測NR5A1基因在湖羊大卵泡和小卵泡中的表達差異，發(fā)現(xiàn)NR5A1基因在湖羊大卵泡中的mRNA表達水平顯著高于小卵泡（P<0.01）（圖6A）。同時Western blot結果也顯示在大卵泡中NR5A1蛋白質的表達量顯著高于小卵泡（圖6B）。說明NR5A1基因參與調控湖羊卵泡的發(fā)育。

3討論

本研究通過克隆測序拼接得到湖羊NR5A1基因從翻譯起始位點開始到翻譯終止位點結束的全序列和編碼區(qū)全序列。湖羊NR5A1基因全序列長度約19 kb，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子。外顯子/內(nèi)含子邊界符合剪接供體和受體的“GT-AG”規(guī)則，與其他哺乳動物一樣。NR5A1基因CDS區(qū)長1 386 bp，編碼461個氨基酸殘基。根據(jù)在氨基酸206位谷氨酰胺殘基的缺失與否，哺乳動物NR5A1蛋白質有461個和462個氨基酸殘基2種類型。而湖羊NR5A1蛋白質屬于在206位沒有谷氨酰胺殘基的類型，與人類和牛一樣。通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)湖羊NR5A1基因在哺乳動物中相對保守，其編碼的氨基酸與人類和牛的NR5A1基因編碼的氨基酸一致性分別為94.04%和98.94%。NR5A1蛋白質具有NR5A家族保守的結構域：①DNA結合域（DBD），由經(jīng)典的cys2-cys2鋅指和FTZ-F1反應元件組成，而NR5A家族與DNA結合的特異性就是由DBD結構域C末端26個氨基酸殘基組成的Ftz-F1盒（Ftz-F1 box）所決定的;②配體結合域（LBD），通過與配體結合反式激活NR5A的靶基因。根據(jù)NR5A1蛋白質氨基酸序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結果與經(jīng)典分類學結果基本一致。正如其他哺乳動物一樣，湖羊NR5A1蛋白質也包含典型的DNA結合區(qū)域和配體結合區(qū)域。因此，高度同源性和保守基序使我們相信湖羊NRSAl基因像其他哺乳動物一樣具有相同的功能。

有報道指出NRSAl基因參與調控性腺和腎上腺發(fā)育以及類固醇激素生成，并且在維持雌性動物卵巢功能和繁殖方面發(fā)揮重要的作用。本研究主要關注NRSAl表達及其是否通過參與調控湖羊卵泡發(fā)育進而調控湖羊的繁殖性能。通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)NR5A1基因在湖羊組織中廣泛表達，但是在卵巢組織中的表達量最高，這與F～ender等研究結果一致。Jin等發(fā)現(xiàn)NR5A1主要在卵泡發(fā)育各個階段的顆粒細胞和卵母細胞中表達，調控類固醇激素的產(chǎn)生進而調控卵泡發(fā)育。同時有研究結果顯示NR5A1能與miR320共同作用阻斷顆粒細胞增殖。miR-764-3p通過影響NR5A1mRNA穩(wěn)定性阻斷其表達進而抑制Cypl9al基因表達，從而調控小鼠卵巢顆粒細胞發(fā)育。Pelusi等研究發(fā)現(xiàn)NR5A1敲除小鼠卵巢發(fā)育不全，卵泡數(shù)量減少，且缺乏黃體，顆粒細胞特異性敲除NR5A1基因顯著影響了卵巢中NR5A1基因靶基因的表達。本研究發(fā)現(xiàn)NPUAl基因在湖羊大卵泡中的表達量顯著高于小卵泡，表明NRSAl基因參與調控湖羊卵泡的發(fā)育，推測其通過調控湖羊顆粒細胞功能參與調控湖羊的繁殖。