呂佩帥，張麗紅*，丁小松，郭芳芳，崔一芳，曹曉亞，徐福洲*

(1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041000；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100097)

胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)是一種革蘭氏陰性短桿菌，感染豬引起以出血性、纖維素性和壞死性肺炎為特征的傳染性胸膜肺炎，不同年齡豬均易感，特別是斷奶仔豬感染后出現(xiàn)較高的發(fā)病率和病死率，而且APP感染后可在鼻腔、呼吸道上皮細胞和扁桃體中定植引起持續(xù)感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失[1]?？咕幬锓乐魏鸵呙缑庖呤悄壳胺揽刎i傳染性胸膜肺炎的最有效手段，但使用抗菌藥物造成APP耐藥性問題日益嚴重[2]，而且通常應(yīng)用的滅活疫苗對APP同種血清型保護效果較好而對不同血清型的交叉保護較差[3-4]，這些問題均給APP的防控帶來挑戰(zhàn)。

據(jù)報道，APP目前已鑒定19個血清型[5-6]，不同血清型之間毒力存在顯著的差異[7]，因而鑒定APP不同血清型菌株的生物學(xué)特性對防控該病原具有重要意義。APP感染豬定植和致病過程中，涉及多種毒力相關(guān)因子[8]，其中主要包括生物膜形成和Apx毒素分泌。APP在適應(yīng)環(huán)境和定植宿主過程中具有形成生物膜的能力，形成生物膜是APP產(chǎn)生耐藥性、逃避宿主免疫和造成持續(xù)感染的重要機制，有利于細菌在豬體內(nèi)定植與感染[9]。此外，Apx毒素也是APP最重要的毒力因子之一[1,7-8]，Apx毒素為RTX(repeats in the structural toxin)毒素家族的重要成員，根據(jù)溶血性和細胞毒性差異分為4種類型，即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ，其中ApxⅠ溶血性和細胞毒性最強，因而分泌ApxⅠ毒素的血清1、5、9、10、11型也是APP中毒力最強的血清型[7]。研究顯示，適當濃度的Ca2+可促進APP表達和分泌Apx毒素[10]；而且APP生長繁殖的不同時相Apx毒素的表達也有顯著差異[11-12]。

本試驗選用APP血清1型～12型參考菌株及2個分離株，首先鑒定APP菌株在不同種培養(yǎng)基中的生長能力，進而鑒定其在不同培養(yǎng)基中形成生物膜的能力及其對不同抗菌藥物的耐藥性，最后鑒定APP菌株在不同培養(yǎng)基中添加Ca2+對Apx毒素分泌的影響。研究結(jié)果將為分析APP不同血清型菌株在不同培養(yǎng)基中的生物學(xué)特性，以及疫苗研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌菌株 APP血清1型～12型參考菌株，由澳大利亞昆士蘭大學(xué)Pat Blackall博士惠贈；分離株JS(血清1型)和JL(血清7型)，由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離鑒定。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 細菌培養(yǎng)用肉湯Brain-Heart Infusion (BHI)、Luria-Bertani (LB)、Mueller-Hinton Broth(MHB)、Pleuropneumonia-Like Organism (PPLO)和Tryptic Soy Broth(TSB)，BD Difco公司產(chǎn)品；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，Sigma公司產(chǎn)品；藥敏紙片，Thermo Fisher Oxoid公司產(chǎn)品；蛋白超濾濃縮管Amicon Ultra-15 10 ku，Millipore公司產(chǎn)品；BioScreener C全自動生長曲線分析儀,Oy Growth Curves Ab Ltd.公司產(chǎn)品；多功能酶標測定儀Synergy H1,Bio-Tek公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌菌株復(fù)蘇和培養(yǎng) 分別將APP保存菌種分區(qū)劃線接種于TSB固體培養(yǎng)板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，然后分別挑取單菌落接種于TSB中37 ℃振搖培養(yǎng)，所有培養(yǎng)基中均添加5 mg/L NAD，APP培養(yǎng)液保種備用。

1.2.2 生長曲線測定 選擇APP血清1型、7型和10型參考菌株，分別培養(yǎng)后測定菌株在BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培養(yǎng)基中的生長曲線。將不同血清型菌株分別在TSB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，離心收集菌體沉淀，經(jīng)0.01 mol/L PBS洗滌2次后，調(diào)整菌懸液OD 600 nm值至1.0，然后分別利用BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培養(yǎng)基進行100倍稀釋，稀釋的菌液加入測定生長曲線的培養(yǎng)板中，每孔200 μL菌液，每個樣品至少設(shè)置5個重復(fù)，空白培養(yǎng)基作為陰性對照，將培養(yǎng)板放入BioScreen C全自動生長曲線分析儀中，每隔2 h測定OD 600 nm值，測定16 h。同樣的試驗重復(fù)3次，取相同樣品的OD 600 nm平均值繪制生長曲線。

1.2.3 生物膜形成測定 采用結(jié)晶紫染色法測定APP血清1型～12型參考菌株及分離株JS和JL在BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培養(yǎng)基中形成生物膜的能力。簡述為：前述處理與生長曲線測定方法相同，即將測定的APP所有菌株培養(yǎng)、洗滌、調(diào)整OD 600 nm值后分別用BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培養(yǎng)基1∶100稀釋，加入96孔聚苯乙烯微孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL菌液，每個樣品3個重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL PBS洗滌3次，然后每孔加入100 μL甲醇固定15 min，棄去甲醇后自然干燥，每孔加入100 μL 10 mg/mL結(jié)晶紫溶液，室溫染色10 min，棄去染液后用PBS洗滌3次，室溫完全干燥，每孔加入100 μL 330 mL/L冰乙酸溶液，37 ℃作用30 min，利用多功能酶標測定儀Synergy H1測定OD 590 nm值。同樣試驗重復(fù)3次，取相同樣品的OD590平均值(D值)，以未接種菌的培養(yǎng)液作為陰性對照，陰性值的2倍作為界限值(Dc)。判定標準為：強生物膜形成(D>2×Dc)；弱生物膜形成(Dc

1.2.4 藥敏試驗 利用頭孢菌素類(頭孢吡肟-4、頭孢唑林、頭孢噻肟-3)、青霉素類(氨芐西林)、碳青霉烯類(亞胺培南)、四環(huán)素類(四環(huán)素、多西環(huán)素)、林可霉素類(克林霉素)、喹諾酮類(環(huán)丙沙星、諾氟沙星、萘啶酸)、氨基糖苷類(慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素)、大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、阿奇霉素)、氯霉素類(氟苯尼考)、磺胺類(甲氧芐啶)、其他(硫酸黏菌素、萬古霉素)等11類20種抗菌藥物，測定APP不同血清型菌株對這些抗菌藥物的敏感性，將大腸埃希氏菌參考菌株ATCC 25922作為藥敏試驗對照菌株，利用Oxoid公司藥敏紙片進行測定，即將APP 12個參考菌株和2個分離株分別培養(yǎng)后調(diào)整OD 600 nm值至1.0，將菌液稀釋1 000倍，取100 μL稀釋菌液均勻涂布TSA平板，粘貼藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)16 h，測量抑菌圈直徑后根據(jù)產(chǎn)品說明書上的標準判定細菌對不同抗菌藥物的耐藥性。

1.2.5 Apx毒素分泌能力測定 將APP血清1型參考菌株在添加NAD的TSB中培養(yǎng)過夜，離心收集菌沉淀，經(jīng)0.01 mol/L PBS洗滌2次后，調(diào)整菌懸液OD 600 nm值至1.0，然后分別按照1∶100稀釋度轉(zhuǎn)接入添加5 mmol/L CaCl2和不添加CaCl2的BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液體積均為20 mL，于37 ℃振搖培養(yǎng)，同時將稀釋的菌液加入測定生長曲線的培養(yǎng)板中，利用Bio Screen C全自動生長曲線分析儀測定生長曲線。取培養(yǎng)6 h菌液經(jīng)10 000 r/min離心20 min，收集上清液加入Amicon Ultra-15 10 ku中離心超濾濃縮，濃縮后體積約為0.5 mL，將蛋白濃縮液加入透析袋中，置于0.01 mol/L PBS中進行透析，透析24 h后吸出透析袋內(nèi)的濃縮液進行SDS-PAGE電泳檢測和Western blot，一抗為ApxⅠ蛋白免疫兔血清，稀釋倍數(shù)為1∶200，二抗為HRP標記羊抗兔抗體，稀釋倍數(shù)為1∶5 000，顯色底物為增強型TMB。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)基中生長曲線測定結(jié)果

為測定APP菌株在不同培養(yǎng)基中的生長能力，選擇了APP血清1型、7型和10型3株參考菌株，測定在BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培養(yǎng)基中的生長情況，測定結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，APP不同菌株在BHI中生長最好，其次為TSB，而在MHB、LB和PPLO中生長較差；菌株在接種培養(yǎng)后2 h～6 h為對數(shù)生長期，6 h～8 h后達到平臺期。

A.血清1型;B.血清7型;C.血清10型

2.2 生物膜形成能力測定結(jié)果

測定了APP血清1型～12型參考菌株及2個分離株在5種培養(yǎng)基中生物膜形成的能力，測定結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，從不同培養(yǎng)基比較結(jié)果看，APP不同血清型菌株在MHB、BHI中生物膜形成能力較強，其次為TSB，而在LB和PPLO中生物膜形成能力較弱，總體趨勢為MHB>BHI>TSB>LB>PPLO(圖2A)；從不同血清型菌株比較結(jié)果看，血清3型、4型、7型、12型參考菌株和分離株JS生物膜形成能力較強，而其他菌株形成能力較弱(圖2B)。

A.APP菌株在5種培養(yǎng)基中形成生物膜的比較；B.APP血清1型～12型參考菌株及2株分離株JS和JL形成生物膜的比較；1～12.參考菌株1～12；JS.分離株JS；JL.分離株JL；超過2×DC表示強生物膜形成能力A.Comparison on the biofilm formation of APP strains in the 5 culture media;B.Comparison on the biofilm formation of APP serovars 1-12 reference strains strains and isolates JS and JL;1-12.Reference strains of A.pleuropneumoniae showed as 1-12;JS.Isolates strain JS；JL.Isolates strain JL；The OD590 values larger than 2×DC means strong biofilm formation ability.

2.3 藥敏試驗結(jié)果

利用藥敏紙片法測定APP血清1型～12型參考菌株及2個分離株的耐藥性，結(jié)果顯示，從不同抗菌藥物類別看，所有菌株對萬古霉素均耐藥，對克林霉素表現(xiàn)中度耐藥，6個菌株對紅霉素中度耐藥，其他抗菌藥物對多數(shù)菌株均敏感；從不同血清型菌株看，血清7型和8型菌株對5種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥性，而其他菌株僅對2種～3種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥性(萬古霉素、克林霉素、紅霉素)。

2.4 Apx毒素分泌測定結(jié)果

APP血清1型菌株以同樣菌量分別轉(zhuǎn)接至BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培養(yǎng)液中，經(jīng)16 h培養(yǎng)后細菌OD 600 nm測定結(jié)果與2.1生長曲線測定結(jié)果一致，即BHI中生長最好，其次為TSB，而在MHB、LB和PPLO中生長較差，而且除TSB外的其他培養(yǎng)基中添加5 mmol/L CaCl2后細菌生長能力稍高于未添加CaCl2的培養(yǎng)基(圖3)。所有培養(yǎng)上清液濃縮至相同的倍數(shù)，即20 mL濃縮至0.5 mL。Western blot檢測結(jié)果顯示，ApxⅠ毒素蛋白在生長不良的培養(yǎng)基MHB、LB和PPLO中表達量顯著高于生長良好的培養(yǎng)基BHI和TSB，特別是BHI中未檢測到明顯ApxⅠ蛋白條帶，而且添加5 mmol/L CaCl2后ApxⅠ毒素分泌量顯著增加(圖4)。

BHI0、LB0、MHB0、PPLO0和TSB0表示在相應(yīng)培養(yǎng)基中未添加CaCl2；BHI5、LB5、MHB5、PPLO5和TSB5表示在相應(yīng)培養(yǎng)基中添加5 mmol/L CaCl2;所有測定時間點的OD 600 nm值均為多個測定值的平均數(shù)

M.蛋白分子質(zhì)量標準;1、2.LB；3、4.TSB；5、6.MHB；7、8.BHI；9、10.PPLO；1、3、5、7、9為不添加CaCl2的培養(yǎng)液；2、4、6、8、10為添加5 mmol/L CaCl2的培養(yǎng)液

3 討論

APP是一種營養(yǎng)要求比較苛刻的病原細菌，自感染豬病料組織中分離成功率較低[1]。張蓉蓉等[13]報道顯示，將免疫磁珠技術(shù)應(yīng)用于自病料中分離APP可顯著提高其分離率。篩選適于APP生長的培養(yǎng)基將有助于其分離培養(yǎng)，且為病原增殖和疫苗制備提供參考。添加NAD的TSB培養(yǎng)基廣泛應(yīng)用于APP的分離培養(yǎng)，本試驗通過比較5種培養(yǎng)基結(jié)果也顯示，不同血清型APP菌株在TSB中均生長良好，在BHI中顯示更好的生長能力，而在MHB、LB和PPLO中均生長不良。本試驗雖然僅使用了3種血清型菌株進行生長能力評價，但生長曲線結(jié)果提示，不同血清型菌株總體培養(yǎng)特性基本一致。

研究顯示APP不同血清型菌株具有形成生物膜的能力[14]，但由于細菌形成生物膜受到多種因素的影響，因而不同文獻報道的結(jié)果并不一致，如Kaplan J B等[15]報道在測定的APP 15個血清型參考菌株中僅血清5b和11型可形成生物膜；而Labrie J等[16]報道APP血清1、3、4、5a、12和14型均可形成生物膜，而且APP血清1型在BHI-B(Oxoid公司)中較BHI-A(BD Difco公司)中生物膜形成能力強。本試驗結(jié)果顯示,APP不同血清型菌株在MHB、BHI中生物膜形成能力較TSB、LB和PPLO強，而且血清3、4、7型和12型參考菌株生物膜形成能力較強。因而多種因素如細菌菌株、血清型、生長狀態(tài)、生長時相、培養(yǎng)材料、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等均影響細菌生物膜形成能力[14]。

通常認為細菌形成生物膜是其適應(yīng)外界環(huán)境、提高耐藥性等的一種機制，因而細菌生物膜形成與耐藥性密切相關(guān)[17]。研究顯示，APP生物膜形成后對抗菌藥物的敏感性大大降低，對抗菌藥物的MIC值較未形成生物膜的細菌可提高100倍～30 000倍[14]；而且對APP分離株研究發(fā)現(xiàn)形成生物膜的APP菌株具有傳遞耐藥性相關(guān)基因的能力[9]。由于本試驗所用菌株對測定的大多數(shù)抗菌藥物均比較敏感，未發(fā)現(xiàn)生物膜形成與耐藥性具有顯著相關(guān)性，但隨著APP臨床耐藥性菌株的逐漸增加，這種相關(guān)性將會愈加明顯。

Apx毒素是APP最重要毒力因子之一，也是研制APP亞單位疫苗的主要組分[4]，篩選和優(yōu)化APP菌株分泌Apx毒素的培養(yǎng)條件為疫苗研制及毒素生物學(xué)研究提供參考。Jarma E等[11-12]研究顯示,APP培養(yǎng)過程中氧氣濃度對ApxⅠ和ApxⅡ的分泌無顯著影響，而細菌生長時相顯著影響Apx毒素的分泌水平，即細菌生長對數(shù)晚期和平臺早期毒素分泌水平最高。Dao H T等[10]通過比較PPLO和Columbia Broth(CB)以及添加不同Ca2+濃度,顯示利用PPLO培養(yǎng)基添加20 mmol/L CaCl2可獲得最大分泌量的Apx毒素。我們研究結(jié)果顯示，ApxⅠ毒素蛋白在生長不良的培養(yǎng)基MHB、LB和PPLO中表達量顯著高于生長良好的培養(yǎng)基BHI和TSB，而ApxⅡ毒素蛋白剛好相反，在生長良好的培養(yǎng)基BHI和TSB以及MHB中可看到明顯的蛋白條帶,而在生長不良的LB和PPLO中未檢測到明顯的ApxⅡ蛋白條帶；而且添加5 mmol/L CaCl2后ApxⅠ和ApxⅡ毒素蛋白分泌量均顯著增加。我們還發(fā)現(xiàn)，如Dao等報道在PPLO培養(yǎng)基中添加20 mmol/L CaCl2時，培養(yǎng)基中形成Ca2+沉淀物導(dǎo)致其渾濁，難以通過測定OD 600 nm值來判定其生長繁殖情況，而在添加5 mmol/L CaCl2時培養(yǎng)基中未見明顯的沉淀物。