蔡智超 吳清來 方守國

摘要：申嗪霉素及其衍生物具有抑菌和抗癌活性。該文檢測了17種申嗪酰胺類衍生物對Vero細胞的毒性和9種該類衍生物禽傳染性支氣管炎病毒（ IBV）復制的影響。結果表明，濃度為10μg/mL時，9種衍生物SQXA-O1、02、06、08、09、11、12、14、16對Vero細胞無毒性，而其他8種衍生物均產(chǎn)生不同程度的毒性;在最大無毒濃度下，SQXA-02、06和16在2種處理方式下均具有較高的抗IBV活性，而SQXA-O1、08、09、11、12在B方式處理下具有較高的抗IBV活性（相對抑制率>80%），而在A方式處理下活性較低。該研究結果為進一步研究衍生物抗病毒的機制和藥物研發(fā)提供了理論支持。

關鍵詞：申嗪酰胺類衍生物;禽傳染性支氣管炎病毒;細胞毒性;抑制作用

中圖分類號：S852.65

文獻標識碼：B

doi：10.3969/j .issn.2096-3637.201 9.10.001

0 引言

申嗪霉素又名吩嗪-1-羧酸（PCA），最早在染料合成中被發(fā)現(xiàn)[1]。19世紀50年代科學家從鏈霉菌（Streptomyceschromogenus sp.）和極毛桿菌（Pseudomonads fluorescens）的代謝物中分離提取到吩嗪-l-羧酸[2]。許煜泉等從假單胞菌株M18（ Pseudomonas sp.）的分泌物中發(fā)現(xiàn)了具有強烈農用抑菌活性的物質，結構鑒定為吩嗪-l-羧酸，研究發(fā)現(xiàn)其具有廣譜性農用抗菌活性[3-4]。在某些癌細胞中，吩嗪-1-羧酸同樣表現(xiàn)出抑制生長的效果[5]，但對于正常細胞則表現(xiàn)為低毒性[6]。在影響病毒復制方面，還未見詳細報道。本研究檢測了17種申嗪酰胺類衍生物對Vero細胞的毒性以及其中9種衍生物對IBV病毒復制的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

17種申嗪酰胺類衍生物均由長江大學農藥研究所提供，見表l。非洲綠猴腎細胞系（ Vero）和表達熒光素酶的禽傳染性支氣管炎病毒（IBV-3ab-Iuc）[7]由本實驗室保存。高糖DMEM細胞培養(yǎng)液、0.25% Trypsin-EDTA、FBS購于Gibco、MTT購于Solarbio。

1.2 試驗方法

1.2 1 申嗪酰胺類衍生物對Vero細胞的最大無毒濃度的測定

DMSO溶解17種申嗪酰胺類衍生物，見表1，使其濃度為10 mg/mL，超聲波震蕩1 min，使化合物充分溶解，常溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

將復蘇后傳代3次的Vero細胞從T75細胞培養(yǎng)瓶接種到12孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔約接種細胞5 x 10⁴個，37℃環(huán)境下5% C02恒溫培養(yǎng)至長滿板底50%時加入化合物，每種化合物設置3種濃度：100、50、10μg/mL，及1個DMSO對照組，3次重復，37℃環(huán)境下5% C02恒溫培養(yǎng)至對照組細胞鏡檢下長滿板底時停止處理。真空泵吸干每孔中的上清液，用2 mL PBS小心清洗3次，每孔加入500μL 0.25%Trypsin-EDTA浸潤10 s后吸出，室溫消化1min，加入1mL含0.1%臺盼藍的PBS重懸細胞，轉移至1.5 mL離心管中，倒置顯微鏡下血球計數(shù)板細胞計數(shù)，并記錄數(shù)據(jù)（藍色細胞不記入其中）。

1.2.2 9種申嗪酰胺類衍生物對IBV-3ab-Iuc病毒復制的影響

將復蘇后傳代3次的Vero細胞從T75細胞培養(yǎng)瓶接種到24孔細胞培養(yǎng)板中37℃環(huán)境下5% CO2恒溫培養(yǎng)，每孔約接種細胞1×10⁴個。按照以下A、B2種加藥方式分開加藥處理，加藥濃度為其對Vero細胞的最大無毒濃度。

A加藥方式：為檢測申嗪酰胺類衍生物是否能刺激Vero細胞產(chǎn)生抗IBV作用，每種化合物設3個重復，設置1個DMSO對照組及1個空白組（不感染病毒），待Vero長滿板底50%后加入9種化合物處理24 h后，吸盡培養(yǎng)液并用PBS洗2次，再加入培養(yǎng)液，而后加入IBV-3ab-luc（MOI=1.0）處理24h。

B加藥方式：為檢測申嗪酰胺類衍生物能否抑制IBV在Vero細胞中的復制，每種化合物設3個重復，設置1個DMSO對照組及1個空白組（不感染病毒）。待Vero長滿板底后加入IBV-3ab-luc（MOI=1.0）處理4h，而后加入9種化合物處理20 h。

吸盡上清液，PBS小心清洗3遍，每孔加入200μLRLB常溫下浸潤5 min，移液器吹打混勻，取50 μL RLB溶解物與50μL Luciferase Substrate混合均勻后放入單管發(fā)光檢測儀（ Promega）中檢測熒光值，記錄數(shù)據(jù)，計算相對抑制率一（1化合物處理后的熒光值/DMSO處理后的熒光值）×100%。

2 結果與分析

2.1 不同濃度申嗪酰胺類衍生物對Vero細胞的毒性測定

通過調查不同濃度申嗪酰胺類衍生物處理后Vero細胞的活細胞數(shù)，確定衍生物對Vero細胞不產(chǎn)生毒性的濃度。結果顯示，與DMSO處理組（細胞數(shù)為1.520×10⁶個）相比，濃度為10 μg/mL時，9種衍生物SQXA-O1、02、06、08、09、11、12、14、16對Vero細胞無毒性，而其他8種衍生物均產(chǎn)生不同程度的毒性，并隨濃度的增高而漸強;濃度為50μg/mL時，只有SQXA-01、06、14和16表現(xiàn)出無毒性;濃度為100μg/mL時，只有SQXA-Ol、14和16表現(xiàn)出無毒性。SQXA-14和16表現(xiàn)出促Vero細胞生長的作用，見表2。由以上數(shù)據(jù)可得9種申嗪酰胺類衍生物在10 - 100μg/mL濃度范圍內的最大無毒濃度：SQXA-OI（50 μg/mL）、SQXA-02（10μg/mL）、SQXA-06（ 100μg/mL）、SQXA-08（ 10μg/mL）、SQXA-09（ 100μg/mL）、SQXA-11（10 μg/mL）、SQXA-12（10μg/mL）、SQXA-14（100μg/mL）、SQXA-16（100μg/mL）。296F7240-825F-4A55-9A5D-E2361C5F476E

2.2 9種申嗪酰胺類衍生物對IBV-3ab-Iuc復制的影響

在上述9種申嗪酰胺類衍生物最大無毒濃度下，檢測其對IBV-3ab-luc復制的影響，所得的熒光值和相對抑制率見表3、表4。結果表明，方式A處理下，9種衍生物均對IBV-3ab-luc復制表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中，SQXA-02、06、14和16的相對抑制率超過50%，分別為54.5%、72.2%、60.0%和76.3%;方式B處理下，SQXA-O1、02、06、08、09、11、12、16具有較高的抗IBV-3ab-Iuc活性，相對抑制率在8 0%以上，但SQXA-14無抗病毒活性。結果顯示，SQXA-02、06和16在A、B2種處理方式下均具有較高的抗IBV活性，說明這3種化合物可直接抑制IBV的復制或通過刺激Vero細胞產(chǎn)生抗病毒物質進而抑制IBV的復制;SQXA-01、08、09、11、12在B方式處理下具有較高的抗IBV活性（相對抑制率>80%），而在A方式處理下活性較低（相對抑制率12.9%～42.7%），說明這5種衍生物可直接抑制IBV的復制;SQXA-14在A方式處理下具有60%的抑制IBV復制的活性，但在B方式處理下無抗病毒活性，原因不明，有待進一步研究。

3 討論與結論

申嗪霉素及其類衍生物具有良好的抗癌和抗菌活性[8-9]，但它們的抗病毒活性未見詳細報道。本文首次檢測了17種申嗪霉素酰胺類衍生物對Vero細胞的毒性和IBV復制的影響。結果表明，衍生物SQXA-04、05、07、10、13、15、17、18在1Oμg/mL時對Vero細胞具有毒性，并隨著濃度的升高，對Vero細胞的毒性漸大;其他9種申嗪酰胺類衍生物在10 - 1OOμg/mL濃度范圍內的最大無毒濃度：SQXA-01（ 50μg/mL）、SQXA-02（10μg/mL）、SQXA-06（100μg/mL）、SQXA-08（10μg/mL）、SQXA-09（100μg/mL）、SQXA-11（10μg/mL）、SQXA-12（10μg/mL）、SQXA-14（100μg/mL）、SQXA-16（ 100μg/mL）;而SQXA-14和16表現(xiàn)出促Vero細胞生長的作用，說明不同的申嗪霉素酰胺類衍生物對Vero細胞的毒性不同。

檢測9種申嗪酰胺類衍生物最大無毒濃度下IBV-3ab-Iuc復制的影響，結果顯示，SQXA-02、06和16在A、B2種處理方式下均具有較高的抗IBV活性，說明這3種化合物可直接抑制IBV的復制或通過刺激Vero細胞產(chǎn)生抗病毒物質進而抑制IBV的復制;SQXA-O1、08、09、11、12在B方式處理下具有較高的抗IBV活性（相對抑制率>80%），而在A方式處理下活性較低（相對抑制率12.9%～ 42.7%），說明這5種衍生物可直接抑制IBV的復制;SQXA-14在A方式處理下具有60%的抑制IBV復制的活性，但在B方式處理下無抗病毒活性，其抗病毒機制正處于研究中。

申嗪酰胺類衍生物分子式相同但取代基團的連接方式或位置不同，表現(xiàn)出不同的生物活性。如SQXA-02和SQXA-05只是CI的位置不同，但SQXA-05對Vero細胞的毒性更高;SQXA-08. SQXA-15和16分子式相同但F的位置不同，SQXA-15對Vero細胞的毒性顯著高于SQXA-08，相反，SQXA-16能促進Vero細胞的生長，且它的抗IBV的活性高于SQXA-08; SQXA-12與SQXA-13，苯環(huán)的連接方式不同，對Vero細胞的毒性存在差異;SQXA-1O. 14和17.Cl的位置不同，SQXA-lO和17在1O - 100μg/mL濃度范圍表現(xiàn)出對Vero細胞的毒性，而SQXA-16能促進Vero細胞的生長。這些作用的機理有待進一步研究。

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基金項目：國家自然科學基金項目——禽傳染性支氣管炎病毒非編碼RNA的形成機制及其生物學功能（31572490）

作者簡介：蔡智超（1993-），男，碩士，從事分子病毒學研究。

通信作者：方守國（1965-），男，教授，從事分子病毒學研究。296F7240-825F-4A55-9A5D-E2361C5F476E