康傳志 呂朝耕 王紅陽 王升 王鐵霖 孫嘉惠 萬修福 周利 郭蘭萍

摘要 目的：評價確證天麻硫熏標志物（p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite）和硫熏天麻水提物的細胞毒性。方法：采用CCK-8試驗方法，考察天麻硫熏標志物和水提物不同劑量下人腎皮質近曲小管上皮細胞、人正常肝細胞和大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞的生長情況，計算相應的細胞活力，并根據相對增殖率進行細胞毒性評級。結果：硫熏標志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite對于人體2種細胞的生長均表現出良好的促進作用，且參照《美國藥典》的毒性分級法，得出該標志物對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞的安全劑量范圍為0～1 000 μmol/L。另外發(fā)現，硫熏天麻水提物對人體正常細胞的細胞活力影響不大，與硫熏前的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），并得出該標志物對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞的安全劑量范圍為0～2.5 μg/mL。結論：在正常的濃度范圍內，硫熏標志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite和硫熏天麻提取物均無細胞毒性，對細胞活力的影響不大。

關鍵詞 天麻;硫熏標志物;p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite;水提物;細胞毒性

Cytotoxicity Evaluation of Sulfur Fumigation Gastrodia Rhizoma Markers and Water Extracts

Kang Chuanzhi，Lyu Chaogeng，Wang Sheng，Wang Tielin，Sun Jiahui，Wang Hongyang，Zhou Li，Guo Lanping

（State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

Abstract Objective：To evaluate the cytotoxicity of the water extract and p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite in sulfur-fumigated Gastrodia Rhizoma.Methods：The CCK-8 test method was used to investigate the growth of human renal cortical proximal tubular epithelial cells，human normal hepatocytes and rat adrenal pheochromocytoma cells at different doses of sulfur-fumigated markers and water extracts for Gastrodia Rhizoma.And the vitality and cytotoxicity ratings based on relative proliferation rates was also evaluated.Results：The p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite had a good promoting effect on the growth of both human cells，and the toxicity of the United States Pharmacopoeia was used to obtain the marker for rat adrenal pheochromocytoma cells.The safe dose range was from 0 to 1000 μmol/L.In addition，it was found that the water extract of sulfur-fumigated Gastrodia Rhizoma had little effect on the cell viability of normal human cells，and there was no significant difference（P>0.05）before and after of sulfur-fumigating Gastrodia Rhizoma，and the safe dose range of the marker on rat adrenal pheochromocytoma cells was 0～2.5 μg/mL.Conclusion：In the normal concentration range，the p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite and water extract of sulfur-fumigated Gastrodia Rhizoma were not cytotoxic，and had little effect on cell viability.

Key Words Gastrodia Rhizoma; Chemical markers of sulfur fumigation; p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite; Water extract; Cytotoxicity

中圖分類號：R282.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.004

硫磺熏蒸（以下簡稱“硫熏”）加工方法作為傳統(tǒng)的中藥材養(yǎng)護方法，具有快速干燥、漂白、防霉、防蟲和延長貯藏期等作用，已廣泛應用到中藥材的初加工和倉儲等環(huán)節(jié)[1-3]。當前中藥材硫熏濫用現象極為普遍，尤其是在產地加工和貯藏保管等環(huán)節(jié)。但大量研究已證實硫熏不僅會影響藥材質量，殘留過量的二氧化硫還會危害人體健康，尤其是藥材進入人體后，對肝和腎臟等重要代謝器官的影響較大[4-9]。課題組前期在對硫熏天麻質量評價的研究中發(fā)現并獲得了硫熏標志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite（p-HS），作為評價天麻硫熏質量控制的重要評價指標[10-11]，但對該硫熏標志物的安全性問題還不得而知。另外，大部分中藥材的服用方式以煎煮為主，因此對硫熏天麻藥材煎煮后的提取物進行安全性評價也是很有必要的。

因此，本研究選取了人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2）人正常肝細胞（L-02）和大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC-12）作為研究評價對象，考察了p-HS標志物和硫熏天麻水提物不同劑量對人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2）、人正常肝細胞（L-02）和大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC-12）的影響，觀察各劑量下HK-2細胞、L-02細胞和PC-12細胞的生長情況，并根據PC-12細胞相對增殖率（Relative Growth Rate，RGR）對硫熏產物p-HS和硫熏藥材提取物進行細胞毒性評級，為中藥材硫磺熏蒸安全性評價提供參考，也為中藥材二氧化硫限量標準的制定提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（HERAEUS公司，德國，型號：BB16）;倒置顯微鏡（Olympus公司，日本，型號：XSZ-D）;全波長酶標儀（thermo公司，芬蘭，型號：Multiskan Go-1510）;超低溫冰箱（三洋公司，日本，型號：MDF-U5412）;96孔培養(yǎng)板（Corning公司，美國，型號：Corning3599）;臺式離心機（上海安亭科學儀器廠，型號：TGL-16C）;電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司，型號：AL104）;電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司，型號：DK-98-ⅡA）。

1.2 試劑 CCK-8試劑（碧云天公司，中國，批號：C0038）;DMEM（Gibco BRL公司，美國，批號：12400024）;新生牛血清（杭州四季青生物工程有限公司，批號：22011-8615）;胰蛋白酶（Amresco公司，美國，批號：0785-5G）;二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司，美國，批號：D4540-1L）;注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號：H13020657）;注射用硫酸鏈霉素（大連美羅藥廠，批號：H21021674）;PBS（Amresco公司，美國，批號：DZ0231）。

1.3 分析樣品 天麻新鮮樣品于2017年11月采自貴州省大方縣的烏天麻，經中國中醫(yī)科學院中藥資源中心郭蘭萍研究員鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的新鮮塊莖，樣本存放于中國中醫(yī)科學院中藥資源中心。天麻硫熏標志物p-HS由中國中醫(yī)科學院中藥資源中心分離制備獲得[10]。人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2，編號：BNCC338012）;人正常肝細胞（L-02，編號：BNCC100012）;大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC-12，編號：BNCC 337663），以上3種細胞購于上海宸功生物技術有限公司。

2 方法

2.1 天麻藥材硫熏處理方法 取新鮮的天麻樣品適量，洗凈晾干表面的水分，切成薄片后，分成2組，一組為空白對照組，另外一組按照硫磺與藥材用量比1∶40，硫熏1 h的硫熏工藝進行硫熏處理。取出后置于50 ℃烘干，放置于4 ℃保存，備用。

2.2 天麻水提物和p-HS標志物母液制備 天麻p-HS標志物母液配制：取p-HS 1.88 mg（即0.01 mmol）溶于含有1‰ DMSO的10 mL培養(yǎng)液，混勻后于4 ℃冰箱中保存。天麻水提物：分別取硫熏前后的干燥天麻藥材100 g，先浸泡30 min，取出后進行煎煮，分2次進行，第1次加10倍量的水，煎煮40 min，第2次加6倍量水，煎煮20 min，濾過，合并濾液，室內減壓回收溶劑或凍干得到4份待測樣品。其中，天麻（TM）、硫熏天麻（TM-S）水提物的質量分別為20.84 g和17.09 g。根據水提物和藥材質量比值，計算得到2份樣品的提取率分別為20.32%和16.99%。

2.3 樣品劑量設置 天麻p-HS標志物：根據細胞抑制率情況以r=10，設置5個濃度梯度，分別為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L和1 000 μmol/L，觀察細胞生長情況及狀態(tài)。天麻提取液：根據HK-2和L-02細胞抑制率情況，設置5個濃度梯度，分別為1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、1 000 μg/mL、2 000 μg/mL，觀察細胞生長情況及狀態(tài)。根據PC-12細胞的抑制率情況，將濃度梯度設置為0.1 μg/mL，0.5 μg/mL，2.5 μg/mL，12.5 μg/mL，62.5 μg/mL。

2.4 細胞培養(yǎng)方法 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.5 CCK-8試驗方法 分別將處于對數生長期的HK-2、L-02和PC-12細胞經胰酶消化后，制成細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，邊緣孔用無菌PBS填充。置5% CO2，37 ℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的p-HS，設置6個濃度梯度，同時設置不加藥的陰性平行對照組。每孔100 μL，設6個復孔。培養(yǎng)24 h后避光加入CCK-8溶液10 μL，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。在酶聯免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光度，計算細胞活力，并將處理組與對照組進行統(tǒng)計分析，重復實驗3次。

2.6 細胞相對增殖率（RGR，%）及細胞抑制率（%）的計算 相對增殖率（RGR，%）=（實驗組吸光度均值/對照組吸光度均值）×100%;細胞抑制率（%）=1-相對增殖率（%）。

2.7 細胞毒性評級標準 根據RGR值，參照《美國藥典》毒性分級法[12]評價細胞毒性，評價標準為：1）RGR值≥100%為0級;2）75%≤RGR值<100%為Ⅰ級;3）50%≤RGR值<75%為Ⅱ級;4）25%≤RGR值<50%為Ⅲ級;5）1%≤RGR值<25%為Ⅳ級;6）0≤RGR值<1%為Ⅴ級。

3 結果

3.1 p-HS對HK-2、L-02和PC-12細胞活性的影響 給予人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2）和人正常肝細胞（L-02）不同劑量的p-HS（0.1 μmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L，100 μmol/L，1 000 μmol/L）處理后，均可不同程度的促進HK-2和L-02細胞的生長。結果見表1和圖1。

CCK-8法檢測HK-2和L-02細胞培養(yǎng)液中細胞生長和增殖活性研究顯示：與正常對照組比較，p-HS藥物對HK-2和L-02細胞均具有不同程度的促進作用，且隨劑量濃度的增加促進作用加強，當濃度為100 μmol/L時，細胞增殖率最高分別達到34.14%和32.04%。同時具有濃度依賴關系，但當藥物濃度達到1 000 μmol/L時，p-HS對HK-2和L-02細胞的促進作用隨即減弱。

給予大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC-12）不同劑量的p-HS均可不同程度的抑制PC-12細胞的生長。CCK-8法檢測PC-12細胞培養(yǎng)液中細胞生長和增殖活性研究顯示：與正常對照組比較，p-HS藥物對PC-12細胞均具有不同程度的毒性作用，且隨劑量濃度的增加抑制作用加強，具有濃度依賴關系。

3.2 p-HS對HK-2、L-02和PC-12細胞毒性等級評定 給予不同劑量的p-HS均可不同程度影響HK-2、L-02和PC-12細胞的增殖，本研究計算細胞相對增殖率對p-HS藥物進行細胞毒性等級評定。一般來說，RGR>50%為合格，RGR<50%為不合格。

根據評定結果，以PC-12細胞為例。見圖1。在所有設置的濃度范圍內，正常組的毒性等級為0級，0.1 μmol/L組和1 μmol/L組的細胞毒性等級為Ⅰ級，剩余3組的毒性等級為Ⅱ級。按照RGR>50%的標準，得到p-HS對PC-12細胞的安全劑量范圍為0～1 000 μmol/L。另外，按照上述評價方法，p-HS對HK-2和L-02細胞的安全劑量范圍同樣為0～1 000 μmol/L。綜上所述，在合理的使用范圍內，p-HS化合物對HK-2、L-02和PC-12細胞的生長是較為安全的。

3.3 天麻水提物對HK-2、L-02和PC-12細胞活性影響 分別給予HK-2、L-02和PC-12 3種細胞不同劑量的TM和TM-S樣品處理，結果得到2組樣品均可不同程度的抑制HK-2、L-02和PC-12細胞的生長。與正常對照組比較，上述2組樣品對HK-2、L-02和PC-12均具有不同程度的抑制作用，且隨劑量濃度的增加抑制作用加強，具有濃度依賴關系。見圖2A、2C、2E。

比較硫熏前后天麻提取物的細胞活性發(fā)現，硫熏后的天麻藥材提取物對HK-2細胞的抑制率明顯低于硫熏前的，說明硫熏后的天麻藥材水提物在一定程度上更有利于HK-2細胞的生長。對于L-02細胞來說，硫熏后的天麻不同劑量的提取物對L-02細胞生長的抑制作用高于硫熏前的樣品，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明硫熏前后的天麻藥材水提物在一定濃度范圍內對HK-2細胞的抑制作用基本一致。通過對HK-2和L-02細胞活性分析，發(fā)現硫熏后的天麻提取物對人體正常HK-2和L-02細胞生長的影響雖然呈現相反的趨勢，但整體來看，硫熏處理對人體正常細胞的生長影響不大。

另外，對PC-12細胞培養(yǎng)液中細胞生長和增殖活性研究顯示，與正常對照組比較，2組樣品對PC-12均具有不同程度的抑制作用，且隨劑量濃度的增加促進作用加強。而且，硫熏后的天麻提取物對非正常PC-12細胞的抑制作用減弱，與硫熏前差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但還是表現出較強的抑制作用。

3.4 天麻水提物對HK-2、L-02和PC-12細胞毒性分析 給予HK-2、L-02和PC-12細胞不同劑量的TM、TM-S、NX、NX-S樣品處理，發(fā)現2組樣品均可不同程度影響HK-2、L-02和PC-12細胞的增殖，且隨著濃度增加增殖作用減弱。計算細胞相對增殖率（GRG）對硫熏前后天麻提取物進行細胞毒性等級評定。一般來說，RGR>50%認為安全，即0級、Ⅰ級和Ⅱ級視為安全范圍。

對HK-2細胞來說（圖2B），TM組的細胞安全劑量范圍為0～100 μg/mL，TM-S組的安全劑量范圍為0～1 000 μg/mL，說明在相同濃度下，硫熏后的天麻水提物對HK-2細胞毒性更小，安全劑量范圍更寬。對L-02細胞來說（圖2D），TM組的細胞安全劑量范圍為0～1 000 μg/mL，TM-S組的安全劑量范圍均為0～100 μg/mL。但從1 000 μg/mL劑量組看，硫熏前后天麻水提物對L-02細胞毒性基本相近，差異無統(tǒng)計學意義。從PC-12細胞來看（圖2F），TM和TM-S2組的安全劑量范圍均為0～2.5 μg/mL，說明硫熏前后天麻藥材提取物對PC-12細胞增殖的影響相對一致。以上表明，硫熏天麻提取物對不同細胞產生的細胞毒性各有差異，既有促進作用，又有抑制作用，但總體上硫熏前后藥材提取物對細胞毒性影響差異無統(tǒng)計學意義。

4 結論

4.1 明確了天麻硫熏標志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite細胞毒性 課題組前期的研究中發(fā)現并分離得到了天麻硫熏標志物p-HS，該成分可作為評價天麻硫熏與否的專屬性質量控制指標。為了明確該標志物對人體是否具有細胞毒性，文章考察了不同劑量p-HS對人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2）、人正常肝細胞（L-02）和大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC-12）的活力的影響。分析認為當濃度范圍在0～100 μmol/L時，p-HS對HK-2細胞和L-02細胞均具有不同程度的促進作用，且隨劑量濃度的增加促進作用加強。當處理濃度達到1 000 μmol/L時，p-HS成分對HK-2和L-02細胞的促進作用隨即減弱，但還是對細胞活力表現出促進作用。這在一定程度上說明該成分對于人體的肝細胞和腎細胞生長均表現出良好的促進作用。此外，對PC-12細胞毒性研究發(fā)現，p-HS藥物對PC-12細胞均具有不同程度的抑制作用，且隨劑量濃度的增加抑制作用逐漸增強。參照《美國藥典》的毒性分級法，得到p-HS對PC-12細胞的安全劑量范圍為0～1 000 μmol/L，也就是說在該濃度范圍內，p-HS單體成分不存在細胞毒性。以上研究說明硫熏天麻藥材中的主要硫熏標志物p-HS不會危害人體健康，甚至對人體肝細胞和腎細胞活力表現出一定的促進作用。

4.2 探明了硫熏天麻提取物的細胞毒性 中藥湯劑是最為常用的一種制劑形式，在臨床應用中也最為廣泛[13]。為進一步探討硫熏中藥材水提物的安全性，按照作者前期研究中得到的最佳硫熏工藝（硫磺與藥材比為1∶40，熏蒸1 h）對天麻進行硫熏處理后，研究其水提物對人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2）、人正常肝細胞（L-02）和大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC-12）的細胞活性和毒性的影響。結果顯示，硫熏天麻提取物對人體正常HK-2和L-02細胞生長的影響雖然呈現相反的趨勢，但整體來看，硫熏處理的藥材水提物對人體正常細胞的生長影響不大，與硫熏前差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。此外，比較硫熏前的，硫熏天麻提取物對非正常PC-12細胞的抑制作用減弱，但整體還是表現出較強的抑制作用。細胞毒性研究發(fā)現，在相同濃度下，硫熏后的天麻水提物對HK-2細胞毒性更小，說明硫熏在一定程度上并未對HK-2細胞產生危害。對L-02細胞來說，硫熏前后天麻水提物對L-02細胞毒性的安全劑量范圍基本相近，并無明顯差異，表明該硫熏工藝條件下，天麻水提物并沒有對L-02細胞毒性產生較大影響。另外，硫熏前后天麻提取物對PC-12細胞的安全劑量范圍為0～2.5 μg/mL，認為硫熏并沒有改變天麻藥材提取物對PC-12細胞毒性的安全劑量。

綜上所述，按照前期提出的最佳硫熏工藝，在正常的濃度范圍內，硫熏天麻提取物不會對HK-2、L-02和PC-12細胞活力產生顯著影響?？梢哉f，按照硫磺與藥材比為1∶40，熏蒸1 h的硫熏工藝進行熏蒸，在保證藥材質量的同時，其硫熏天麻藥材提取物對HK-2、L-02和PC-12無明顯的細胞毒性，能夠較好地保證藥材質量安全。

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（2019-10-15收稿 責任編輯：王明）

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFC1700701）;國家自然科學基金項目（81891014）;財政部中央本級專項（2060302）;國家發(fā)改委標準化項目（ZYBZH-C-HLJ-17，ZYBZH-C-GD-07）;現代農業(yè)產業(yè)技術項目（CARS-21）;中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金資助項目（ZZXT201806）作者簡介：康傳志（1989.11—），男，博士，助理研究員，研究方向：中藥質量評價與生態(tài)種植，E-mail：kangchuanzhi1103@163.com通信作者：郭蘭萍（1969.08—），女，博士，研究員，研究方向：中藥資源生態(tài)學，E-mail：glp01@126.com