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        UPLC-MS/MS法測定不同產(chǎn)地何首烏中6種水溶性維生素含量

        2019-09-10 21:31:44周利郭蘭萍高峰李佳興余意馬方勵楊健
        世界中醫(yī)藥 2019年11期
        關(guān)鍵詞:何首烏

        周利 郭蘭萍 高峰 李佳興 余意 馬方勵 楊健

        摘要 目的:建立超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS/MS)測定何首烏中水溶性維生素類成分的分析方法。方法:將粉碎后的何首烏樣品用超純水超聲提取后,經(jīng)ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)分離并在動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下檢測,得到相應(yīng)的提取離子流圖,以峰面積進(jìn)行定量。結(jié)果:何首烏中6個水溶性維生素的含量差別較大,其中VB4為何首烏中維生素的主要來源,在6個維生素類化合物中的含量最高,達(dá)到85.89 μg/g;VB6平均含量最低,僅為0.68 μg/g。其余4種維生素類成分VB2、VB5、NA和NAM的平均含量均相對較低。結(jié)論:該法簡單快速,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,重復(fù)性好,為何首烏中水溶性維生素類成分的深入研究以及何首烏保健產(chǎn)品的開發(fā)提供了參考依據(jù)。

        關(guān)鍵詞 何首烏;水溶性維生素;超高效液相-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用;含量分析

        Determination of 6 Water-Soluble Vitamins in Polygoni Multiflori Radix from Different Habitants by UPLC-MS/MS

        Zhou Li1,Guo Lanping1,Gao Feng2,Li Jiaxing1,Yu Yi3,Ma Fangli3,Yang Jian1

        Abstract Objective:To establish an Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Mass/Mass Spectrometry(UPLC-MS/MS)method to determine the contents of water-soluble vitamins in Polygoni Multiflori Radix from different habitants.Methods:The pulverized Polygoni Multiflori Radix sample was ultrasonically extracted with ultrapure water,separated by an ACQUITY UPLC BEH C18 column(2.1 mm × 100 mm,1.8 μm)and detected under dynamic multiple reaction monitoring mode(MRM)to obtain the corresponding extracted ions Flow chart,and quantified by peak area.Results:The contents of 6 water-soluble vitamins in Polygoni Multiflori Radix had great differences.Among them,the content of VB4 was the highest which was 85.89 μg/g; and the content of VB6 was the lowest which was only 0.68 μg/g.The average content of the other 4 vitamins,VB2,VB5,NA and NAM,was relatively low.Conclusion:The method is simple,accurate and reproducible.It provides a reference for the follow-up research of water-soluble vatamins and health food development of Polygoni Multiflori Radix.

        Key Words Polygoni multiflora Radix; Water-soluble vitamins; UPLC-MS/MS; Content analysis

        中圖分類號:R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.008

        何首烏為蓼科植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥塊根,味苦、甘、澀,性微溫,歸肝、心和腎經(jīng)[1],是一種常用補(bǔ)益中藥,最早載于《日華子本草》,曰:“其藥本草無名,因何首烏見藤夜交,便即采食有功,因以采人為名耳”[2]。何首烏另有地精、仙藥、首烏等別名,生用可解毒、消癰、潤腸通便,制用能補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、益精血、烏須發(fā),歷來被古今醫(yī)家、食療養(yǎng)生家所推崇,在醫(yī)療、保健、化工等領(lǐng)域占有重要地位[3-4]。目前何首烏生品及炮制品均已納入我國保健食品原料名錄。

        維生素又名維他命,是維持人體正常功能不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì),也是保持機(jī)體健康不可缺少的活性物質(zhì)。研究表明,維生素缺乏將會導(dǎo)致包括皮炎、脫屑、口腔潰瘍、壞血病、兒童佝僂病等在內(nèi)的一系列癥狀及疾病,同時,維生素對一些疾病也有一定的治療作用,如研究表明,葉酸、維生素能夠降低腦梗死患者血中HCY的水平,降低患者死亡率[5];維生素C可作為電子供體在細(xì)胞中產(chǎn)生過氧化氫殺傷腫瘤細(xì)胞,在腫瘤治療中具有廣闊前景[6-7]。作為一種重要的功能因子,維生素是各類食品,醫(yī)療、保健品原料的重要檢測指標(biāo);而其在何首烏中的含量卻鮮有報道。本研究以超高效液相色譜三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)建立了同時測定何首烏中6種水溶性維生素成分維生素B2(VB2)、維生素B4(VB4)、維生素B5(VB5)、維生素B6(VB6)、煙酸(NA)和煙酰胺(NAM)的方法,并以不同產(chǎn)地來源的15批何首烏樣品為研究對象,對其所含的該類成分的含量水平進(jìn)行了分析及評價,以期為何首烏的深入研究及保健產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器 ACQUITY UPLCTM系統(tǒng)(Waters公司,美國,型號:I-Class),API四級桿-線性離子阱質(zhì)譜儀(ABSCIEX公司,配有離子噴霧接口,美國,型號:6500),電子天平(梅特勒-托利多有限公司,瑞士,型號:NewClassic MF),超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司,型號SB800DTD),Eppendorf離心機(jī)(Eppendorf公司,德國,型號:5810R)。

        1.2 試劑 色譜級甲醇和乙腈(Fisher Scientific公司,美國,I1014107923、JB081430);乙酸銨(LC/MS分析用,F(xiàn)isher Scientific公司,美國,批號A639-500);水為自制超純水,來至賽默飛超純水系統(tǒng)(電阻率為18.2 M/cm,美國,型號GenPure)。對照品:維生素類化合物對照品共6個,分別為:維生素B2(VB2,批號B21290)、維生素B4(VB4,批號18108459072)、維生素B5(VB5,批號B21291)、維生素B6(VB6,批號B21292)、煙酸(NA,批號BCBH1877V)、煙酰胺(NAM,批號J16N8R47789)。其中維生素B2、煙酸、煙酰胺和維生素B5購買于北京北京融誠鑫德科技發(fā)展有限公司;維生素B4和維生素B6購買于上海士峰生物科技有限公司。以上對照品純度均大于98%。

        1.3 分析樣品 本研究所用何首烏采自四川、廣東、云南等何首烏主產(chǎn)區(qū),經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心金艷鑒定為蓼科植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥塊根,采集具體信息見表1。

        2 方法

        2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動相A:10 mmol/L乙酸銨,流動相B:乙腈,流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL,柱溫:40 ℃,梯度洗脫:0~1.5 min,流動相A 95%→95%;1.5~4 min,流動相A 95%→45%;4~4.5 min流動相A 45%→95%;4.5~6 min,流動相A 95%→95%。

        2.2 質(zhì)譜條件 離子源:Turbo V;電離模式:ESI+;氣簾氣(CUR)體積流量:30 L/min,;噴霧電壓(IS):5500 V;霧化氣(GS1)體積流量:50 L/min;加熱輔助氣(GS2)體積流量:50 L/min;采集方式:MRM;離子化溫度(TEMP):550 ℃。優(yōu)化的條件參數(shù)見表2。

        2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取維生素類標(biāo)準(zhǔn)品適量,制備成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,其中維生素B2用10%的氨水為溶劑配成單一成分對照品儲備液,其他維生素用10 mmol/L乙酸銨:甲醇(9∶1)的溶液為溶劑分別配成單一成分對照品儲備液。分別精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量,分組配制成適量濃度的各混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,其中維生素B2為第1組,維生素B4、維生素B5和煙酸為第2組,維生素B6和煙酰胺為第3組。

        2.4 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末50 mg,置于離心管中,精密加入超純水1.5 mL,稱定重量,超聲提取30 min(功率:250 W,頻率:40 kHz),再稱定重量,用超純水補(bǔ)足減少的質(zhì)量,12 000 r/min離心10 min,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。放置于4 ℃冰箱供UPLC-MS/MS分析用。

        2.5 線性關(guān)系考察

        取上述3組混合對照品溶液,逐級稀釋為7個不同質(zhì)量濃度的標(biāo)曲混標(biāo)溶液,采用2.2和2.3項(xiàng)下條件進(jìn)行測定,以色譜峰面積Y為縱坐標(biāo),進(jìn)樣濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)得到回歸方程、線性范圍與相關(guān)系數(shù),結(jié)果見表3。結(jié)果表明,6種目標(biāo)成分在各自的濃度范圍內(nèi)線性良好。

        2.6 中間精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一混合對照品溶液,連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次,測得各目標(biāo)化合物峰面積的RSD范圍為0.54%~2.67%,證明儀器精密度良好。

        2.7 供試品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液,分別于0、1、2、3、6 h進(jìn)樣,以測定化合物穩(wěn)定性。結(jié)果顯示,各維生素類化合物在6 h內(nèi)測定值的RSD在2.32%~3.87%之間,證明化合物穩(wěn)定性良好,滿足分析需要。

        2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一份何首烏樣品,精密稱定6份,按本研究所述提取方法提取完成并過濾測定。結(jié)果顯示,各目標(biāo)化合物測定值的RSD在1.78%~4.37%之間,證明方法重復(fù)性良好。

        2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取何首烏樣品5份,向其中加入一定質(zhì)量濃度的對照品溶液。按照2.4項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣分析,以計算所得的實(shí)際值與加入量的比值即為回收率。6個維生素的平均加樣回收率:維生素B2為95.3%,維生素B4為102.9%,維生素B5為96.2%,煙酸為104.3%,煙酰胺為95.8%,維生素B6為105.6%,其RSD均小于6.0%。

        2.11 樣品的測定結(jié)果 取各產(chǎn)地何首烏供試品溶液,按照優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測定,測定結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及實(shí)際稱樣量進(jìn)行計算,進(jìn)而得到樣品中各化合物的含量。見表4。

        3 討論

        不同產(chǎn)地何首烏維生素的總含量在52.97~186.50 μg/g之間,平均含量為108.13 μg/g。其中VB4為何首烏中維生素的主要來源,在6個水溶性維生素中的含量最高,平均值達(dá)到85.89 μg/g;VB6平均含量最低,僅為0.68 μg/g。其余4種維生素類化合物在何首烏中的含量均分布在0~10 μg/g之間,VB2、NAM、VB5和NA的平均含量依此為8.41 μg/g、6.67 μg/g、3.25 μg/g和3.23 μg/g。

        不同產(chǎn)地來源的樣品中,以廣西玉林何首烏中維生素總量最高,達(dá)到186.50 μg/g,其次是廣東高州產(chǎn)何首烏,其維生素總含量為177.79 μg/g;此外,分別來自四川達(dá)州、四川宜賓、四川遂寧和貴州凱里的樣品中維生素類成分總含量均達(dá)到100 μg/g以上,分別為157.62 μg/g、122.29 μg/g和127.29 μg/g。其余產(chǎn)地藥材中維生素總量均低于100 μg/g,最低的為安徽亳州產(chǎn)樣品,僅為52.97 μg/g,為廣西玉林何首烏總維生素含量的28.40%。

        本研究還同時檢測了何首烏中的VB1、VC、VB7和VB8 4種成分,但此4種成分在何首烏藥材中均未檢出。研究利用UPLC-MS/MS法測定了不同產(chǎn)地何首烏藥材中6種水溶性維生素成分的含量。該法簡單快速,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,重復(fù)性好,為何首烏后續(xù)的相關(guān)研究提供了參考依據(jù)。

        參考文獻(xiàn)

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        (2019-10-15收稿 責(zé)任編輯:王明)

        基金項(xiàng)目:財政部中央本級專項(xiàng)(2060302);國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81603241);國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目(2017YFC1700701)作者簡介:周利(1992.10—),女,碩士,研究實(shí)習(xí)員,研究方向:中藥材質(zhì)量分析與評價,E-mail:zhouli3131@163.com通信作者:楊?。?981.07—),男,博士,副研究員,研究方向:中藥資源,E-mail:yangchem2012@163.com

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