吳婧婧 梁貴秋 陸春霞 董桂清 周曉玲 肖瀟

摘要：【目的】優(yōu)化桂桑優(yōu)12種子油提取工藝條件，并分析其抗氧化活性，為廣西主推桑樹品種桂桑優(yōu)12種子油提取和高值化利用提供技術支持?！痉椒ā恳怨鹕?yōu)12種子為試驗材料，種子油提取率為評價指標，從5個溶劑組合中篩選出提取桂桑優(yōu)12種子油的最佳溶劑;并在單因素試驗的基礎上，將3個顯著因素的最佳條件設為響應中心值，利用響應面法對種子油提取工藝進行優(yōu)化，依據(jù)回歸分析確定其最適提取條件;同時測定種子油對DPPH和羥基自由基的清除率?！窘Y果】體積百分比為40%正己烷+60%石油醚的組合是提取桂桑優(yōu)12種子油的適宜溶劑;各因素對桂桑優(yōu)12種子油提取率的影響排序為提取溫度>提取時間>提取溶劑體積;桂桑優(yōu)12種子油的最佳提取工藝條件為：提取溫度83 ℃、提取溶劑體積50 mL、提取時間4.0 h，在此條件下，得到桂桑優(yōu)12種子油提取率為35.04%，與預測值（35.07%）接近;桂桑優(yōu)12種子油對DPPH和羥基自由基均有較強的清除能力，其半數(shù)有效質量濃度（IC50）分別為2.111和0.196 mg/mL?！窘Y論】響應面試驗模型能較好優(yōu)化桂桑優(yōu)12種子油的提取工藝，優(yōu)化后的工藝具有操作便捷、高效可行的優(yōu)勢，提取的種子油具有較強抗氧化能力。

關鍵詞： 桂桑優(yōu)12;種子油;提取工藝;提取率;抗氧化性;響應面分析

中圖分類號： S888.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）01-0144-07

0 引言

【研究意義】桂桑優(yōu)12是廣西優(yōu)良的雜交桑樹品種，其特點為葉片較大而厚，主要表現(xiàn)為產量高、葉質優(yōu)、易采摘、耐剪伐、易繁育（種子繁育）、適應廣，可在廣西各地規(guī)模種植，受到廣大蠶農的歡迎;作為廣西主推桑品種，其種植面積于2012年已達7.24萬ha，占廣西桑園面積的43.05%（聶良文等，2013）。桂桑優(yōu)12的附屬產品桑果在廣西已被開發(fā)利用成為桑果酒和桑椹汁，而在榨取果汁時留下的桑種子開發(fā)利用價值尚未挖掘出來，造成資源浪費。桑種子約占果實的2.8%，在生產中常用渣汁分離設備將果汁與果渣分離，桑果經渣汁分離后所得的桑種子與果渣混合在一起，可在孔徑1～2 mm的網篩中清洗實現(xiàn)與果渣分離，收集過程簡單、易操作。桂桑優(yōu)12的種子含油率高達35.0%以上，高于一般的桑種子含油率（32.3%～33.4%）（吳娛明等，2006;呂志強等，2011）。桑種子油富含不飽和脂肪酸，含量約占88%，其中亞油酸占79%以上，同時富含維生素E、β-胡蘿卜素、硒等多種維生素和微量元素（楊小蘭等，1998），具有降血脂、抗動脈粥樣硬化等作用，對延緩機體衰老十分有益（楊小蘭，2011）。因此，研究桂桑優(yōu)12種子油的提取工藝及其抗氧化活性，不僅能將廣西豐富的桑樹資源更廣泛應用于食品領域，滿足廣大消費者的需求，還可提高桑樹資源綜合利用率和加工產品附加值?！厩叭搜芯窟M展】目前關于桑種子油的研究已有一些報道。楊小蘭等（1998）分析了桑椹籽和籽油的化學成分;張志偉等（2007）利用超臨界CO2流體萃取桑椹籽油，并采用氣相色譜法對桑椹籽油進行組分分析;徐建國等（2009）通過正交試驗優(yōu)化桑椹籽油提取工藝，并對其脂肪酸組成進行分析;胡青平（2010）利用超聲波輔助提取桑椹籽油。針對桂桑優(yōu)12桑樹資源進行的研究也有一些報道，徐周徐和屈達才（2014）測定了桂桑優(yōu)12和沙2×倫109的DNJ含量，發(fā)現(xiàn)桂桑優(yōu)12的DNJ含量高于沙2×倫109;陸春霞等（2018）利用桂桑優(yōu)12的果實制成桑果酒，并與其他兩種桑果酒進行理化指標和成分比較，發(fā)現(xiàn)桂桑優(yōu)12釀制的桑果酒的抗氧化物質白藜蘆醇和花青素成分較高。關于桑種子的抗氧化性研究較少，目前僅孟祥凱等（2015）采用不同極性的溶劑提取桑種子，發(fā)現(xiàn)桑種子的提取物具有較強的抗氧化能力?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于桂桑優(yōu)12種子的研究鮮見報道，涉及其種子油的抗氧化性研究也未見報道?！緮M解決的關鍵問題】以桂桑優(yōu)12種子為原料，通過單因素試驗和響應面設計，篩選出最佳提取溶劑，考察提取溶劑體積、提取溫度和提取時間對種子油提取率的影響，確定桂桑優(yōu)12種子油提取的最佳工藝，并研究其抗氧化活性，為廣西主推桑樹品種桂桑優(yōu)12的種子油提取和高值化利用提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為桂桑優(yōu)12種子，由廣西蠶業(yè)技術推廣總站提供。石油醚、正己烷和雙氧水購自西隴化工股份有限公司，鄰二氮菲和七水合硫酸亞鐵購自國藥集團化學試劑有限公司。主要設備儀器：SZF-06C脂肪提取器（浙江托普云農科技股份有限公司），752型紫外—可見分光光度計（上海光學儀器廠）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 種子油提取 有機溶液脂肪提取法：準確稱取烘干至恒重且過80目篩的桑種子粉末4.000 g置于濾紙筒中，將濾紙筒放入抽提瓶內，并加入適量的有機溶劑，于一定溫度和時間下回流提取種子油。

種子油提取率（%）=種子油質量/桑種子粉末

質量×100

1. 2. 2 提取溶劑組合篩選 將種子油提取中最常用的兩種試劑正己烷和石油醚按照不同體積百分比進行組合（組合1：100%正己烷，組合2：60%正己烷+40%石油醚，組合3：50%正己烷+50%石油醚，組合4：40%正己烷+60%石油醚，組合5：100%石油醚），混合至50 mL，作為提取溶劑分別進行種子油提取試驗，篩選出最適合桂桑優(yōu)12種子油提取的溶劑組合。

1. 2. 3 單因素試驗 按照1.2.1的方法提取桂桑優(yōu)12種子油，研究不同提取溶劑浸泡時間（0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h）、提取溶劑體積（30、40、50、60和70 mL）、提取溫度（60、70、80、90和100 ℃）和提取時間（1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 h）對種子油提取率的影響，進行3次重復試驗。

1. 2. 4 響應面試驗設計 根據(jù)單因素試驗的結果，以提取溶劑體積、提取溫度和提取時間為響應面自變量，以種子油提取率為響應值，通過Design Expert 7.0設計3因素3水平共計17個試驗點的響應面試驗，以隨機次序進行，重復3次獲得響應值，優(yōu)化種子油提取工藝。響應面因素水平見表1。

1. 2. 5 種子油抗氧化性測定

1. 2. 5. 1 DPPH自由基清除率測定 參考Ali等（2015）的方法，將桂桑優(yōu)12種子油分別用無水乙醇配成質量濃度為2、4、6、8、10和12 mg/mL的溶液，并配置60 μmol/L DPPH溶液。取2 mL樣品溶液分別置于10 mL具塞試管里，加入等體積DPPH溶液，混勻后于25 ℃下避光反應20 min;樣品溶液取出后以無水乙醇調零，在517 nm波長下測定吸光值A1;取2 mL無水乙醇加入2 mL 60 μmol/L DPPH溶液中，測定吸光值A0;取2 mL樣品溶液加入2 mL無水乙醇中，測定吸光值A2。每個試驗測定結果重復3次，取平均值，根據(jù)公式計算DPPH自由基清除率，以維生素C（VC）作參照。

DPPH自由基清除率（%）=[A0-（A1-A2）A0]×100

1. 2. 5. 2 羥基自由基清除能力測定 參考董迪迪等（2014）的方法進行測定。建立反應體系所需的溶液和試劑：0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液、0.01% H2O2、磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）及不同質量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mg/mL）的桂桑優(yōu)12種子油乙醇溶液。不同分組的溶液加入反應體系的體積見表2。

將反應體系在37 ℃水浴下反應1.0 h，取出后迅速在536 nm處測定吸光值，每個試驗結果重復3次，取平均值，根據(jù)公式計算羥基自由基清除率，以VC作參照。

羥基自由基清除率（%）=[A2-A1A0]×100

1. 3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0進行差異顯著性分析和回歸擬合曲線確定半數(shù)有效質量濃度（IC50），并用Design Expert 7.0對試驗數(shù)據(jù)進行響應面分析。

2 結果與分析

2. 1 最佳提取溶劑組合的篩選結果

由圖1可知，除組合3與組合5的種子油提取率間差異不顯著（P>0.05，下同）外，其余組合的提取率間均存在顯著差異（P<0.05，下同），以組合4（40%正己烷+60%石油醚）的種子油提取率最高（32.45%），組合5（100%石油醚）的種子油提取率次之（32.31%），而組合1（100%正己烷）的種子油提取率最低，為31.59%。因此，確定40%正己烷+60%石油醚的組合為桂桑優(yōu)12種子油提取工藝最適合的提取溶劑。

2. 2 單因素試驗結果

2. 2. 1 提取溶劑浸泡時間對桂桑優(yōu)12種子油提取率的影響 為了使桑種子粉末與提取溶劑充分接觸，提取前先將桑種子粉末放入濾紙筒，用提取溶劑浸泡一定時間，在提取溫度90 ℃、提取體積50 mL、提取時間5.0 h的條件下進行提取試驗，考察提取前不同浸泡時間對桂桑優(yōu)12種子油提取率的影響。由圖2可知，在不同浸泡時間處理下，桂桑優(yōu)12種子油的提取率在32.36%～32.44%，其中浸泡時間2.0 h的種子油提取率最高。根據(jù)差異性分析可知，不同浸泡時間處理下所得種子油提取率間無顯著差異，表明桑種子在提取前采用提取溶劑浸泡處理的時間對種子油提取率無顯著影響。

2. 2. 2 提取溶劑體積對桂桑優(yōu)12種子油提取率的影響 在提取溶劑浸泡時間2.0 h、提取溫度90 ℃，提取時間5.0 h的條件下，考察不同提取溶劑體積對桂桑優(yōu)12種子油提取率的影響。由圖3可知，提取溶劑體積在30～50 mL范圍內，桂桑優(yōu)12種子油提取率呈上升趨勢，當提取溶劑體積為50 mL時提取率達最大值（32.45%）。根據(jù)差異性分析可知，提取溶劑體積在50～70 mL范圍內的提取率差異不顯著，但顯著高于溶劑體積為30和40 mL的提取率。由于提取溶劑體積達60 mL時，提取率并未隨溶劑體積的增大而增加，且從節(jié)約材料的角度考慮，故選擇50 mL作為種子油提取的最適提取溶劑體積。

2. 2. 3 提取溫度對桂桑優(yōu)12種子油提取率的影響 在提取溶劑浸泡時間2.0 h、提取溶劑體積50 mL、提取時間5.0 h的條件下，考察不同提取溫度對桂桑優(yōu)12種子油提取率的影響。由圖4可知，提取溫度在60～90 ℃范圍內，種子油提取率呈上升趨勢，當提取溫度為90 ℃時提取率達最大值（30.99%），之后提取率出現(xiàn)下降趨勢，各提取溫度下的提取率間存在顯著差異。提取溫度升高影響提取率的原因在于提取溶劑的流動性和沸騰性，當提取溫度過高并達到石油醚和正己烷的沸點時，溶劑揮發(fā)使得溶劑體積減少，導致種子油提取率隨之下降。因此，選擇90 ℃作為種子油提取的最適提取溫度。

2. 2. 4 提取時間對桂桑優(yōu)12種子油提取率的影響 在提取溶劑浸泡時間2.0 h、提取溶劑體積50 mL、提取溫度90 ℃的條件下，考察不同提取時間對桂桑優(yōu)12種子油提取率的影響。由圖5可知，提取時間在1.0～4.0 h范圍內，桂桑優(yōu)12種子油提取率呈上升趨勢，當提取時間為4.0 h時提取率達最大值（30.83%），顯著高于除5.0 h外的其他提取時間，提取時間達5.0 h時提取率出現(xiàn)下降趨勢。若提取時間不足，油脂提取不完全;若提取時間過長，又可能出現(xiàn)油脂揮發(fā)，導致提取率下降，因此選擇4.0 h的提取時間較適宜。

2. 3 響應面優(yōu)化提取工藝的結果

2. 3. 1 響應面試驗結果 利用Design Expert 7.0對響應面試驗結果（表3）進行方差分析，根據(jù)試驗結果得到桂桑優(yōu)12種子油提取率（Y）對提取溫度（A）、提取溶劑體積（B）和提取時間（C）3個因素的二次多項回歸方程：Y=34.42-1.88A-0.66B+0.76C-1.23AB+0.22AC-0.11BC-1.42A2-1.86B2-3.36C2。

對模型進行回歸分析，結果（表4）表明，該模型顯著性檢驗P=0.0002<0.01，二次方程擬合極顯著，該模型具備統(tǒng)計學意義。失擬項P=0.0561>0.05，差異不顯著，表明該模型能較好地描述各因素與響應值間的真實關系;決定系數(shù)R2=0.9695，表明該模型擬和程度良好，可通過該回歸方程確定桂桑優(yōu)12種子油提取的最佳工藝。通過比較F的大小可知，各因素對桂桑優(yōu)12種子油提取率的影響順序為A>C>B，各因素交互作用對種子油提取率的影響順序為AB>AC>BC。根據(jù)P的大小可知，各因素中B、C和AB對種子油提取率的影響顯著，A、A2、B2和C2對種子油提取率的影響極顯著（P<0.01）。

2. 3. 2 響應面交互作用分析 采用Design Expert 7.0對表3數(shù)據(jù)繪制響應面圖（圖6），可真實反映出各因素間的交互作用，曲面圖的陡峭程度顯示出各因素對桂桑優(yōu)12種子油提取率的影響程度，響應面坡度越陡，說明該因素影響較大。從圖6可看出，AB交互作用響應面的坡度較陡峭，說明提取溫度與提取溶劑體積的交互作用對桂桑優(yōu)12種子油提取率的影響顯著;AC和BC響應面的坡度均較平緩，說明提取溫度與提取時間、提取溶劑體積與提取時間的交互作用對桂桑優(yōu)12種子油提取率的影響不顯著。提取溫度響應面的陡峭程度大于提取時間和提取溶劑體積，說明提取溫度對種子油提取率的影響大于提取時間和提取溶劑體積;提取時間響應面的陡峭程度大于提取溶劑體積，說明提取時間對種子油提取率的影響大于提取溶劑體積。這與表5的方差分析結果一致。

2. 3. 3 試驗結果的驗證 利用Design Expert 7.0進行數(shù)據(jù)分析，可得到桂桑優(yōu)12種子油提取率的最優(yōu)工藝條件：提取溫度83.26 ℃、提取溶劑體積50.43 mL、提取時間4.09 h，在此工藝條件下的桂桑優(yōu)12種子油提取率為35.07%。為了確保實際操作的可行性，將工藝參數(shù)優(yōu)化為提取溫度83 ℃、提取溶劑體積50 mL、提取時間4.0 h，經3次重復試驗，得到桂桑優(yōu)12種子油提取率35.04%，與預測值接近，說明該工藝穩(wěn)定可行，建立的模型適用于預測實際值。

2. 4 桂桑優(yōu)12種子油的抗氧化性分析結果

2. 4. 1 桂桑優(yōu)12種子油對DPPH自由基的清除效果 由圖7可知，在試驗濃度范圍內，桂桑優(yōu)12種子油對DPPH自由基具有良好的清除效果，其清除能力隨桂桑優(yōu)12種子油的濃度增大而增強。以VC為對照進行DPPH自由基清除能力比較，桂桑優(yōu)12種子油的清除率最大值為92.71%，稍低于VC的DPPH自由基清除率。桂桑優(yōu)12種子油的IC50為2.111 mg/mL。

2. 4. 2 桂桑優(yōu)12種子油對羥基自由基的清除效果 由圖8可知，桂桑優(yōu)12種子油對羥基自由基具有良好的清除效果，其清除能力與質量濃度呈正相關。在0.2～0.7 mg/mL質量濃度范圍內，桂桑優(yōu)12種子油對羥基自由基的清除能力強于VC，但隨著質量濃度增大，VC對羥基自由基的清除能力逐漸強于桂桑優(yōu)12種子油。桂桑優(yōu)12種子油的羥基自由基清除率最大值為88.53%，通過擬合曲線計算出桂桑優(yōu)12種子油的IC50為0.196 mg/mL。

3 討論

目前，對種子油的提取溶劑多采用單一石油醚或正己烷，如徐建國等（2009）采用石油醚作為提取溶劑，通過正交試驗優(yōu)化桑椹籽油的提取工藝，該優(yōu)化工藝條件下獲得的桑椹籽油提取率為28.62%;呂志強等（2011）用正己烷對桑籽油進行提取，并采用正交試驗進行工藝優(yōu)化，該優(yōu)化工藝條件下獲得的桑椹籽油提取率為32.33%。本研究采用石油醚和正己烷通過不同體積比例混合提取桂桑優(yōu)12種子油，發(fā)現(xiàn)40%正己烷+60%石油醚的混合溶劑作為桂桑優(yōu)12種子油的提取溶劑，所得到的種子油提取率最高，從而確定該比例的混合溶劑為最佳提取溶劑。根據(jù)篩選出的提取溶劑，又在單因素試驗的基礎上，以提取溶劑體積、提取溫度和提取時間為響應面的影響因素，以種子油提取率為響應值，設計了3因素3水平的響應面試驗優(yōu)化工藝，得到最佳提取條件為提取溫度83 ℃、提取溶劑體積50 mL、提取時間4.0 h，在此條件下得到桂桑優(yōu)12種子油提取率為35.04%，高于單一采用石油醚和正己烷作為提取溶劑的提取工藝（徐建國等，2009;呂志強等，2011）。本研究所獲得的桂桑優(yōu)12種子油提取率略低于胡青平（2010）獲得的桑椹籽油提取率（35.62%），主要是由于其采取了超聲波輔助方式，下一步可考慮將本研究的優(yōu)化提取工藝條件與輔助方法相結合進行桂桑優(yōu)12種子油的提取研究。

桑樹種子的提取物具有較強的抗氧化活性，孟祥凱等（2015）采用不同極性的溶劑提取桑籽，發(fā)現(xiàn)以乙酸乙酯提取的桑籽提取物清除DPPH自由基能力最強，其半最大效應濃度（EC50）為0.0540 mg/mL，清除率在90.00%以上。桑種子油的抗氧化性研究目前尚未見報道，而對于葡萄籽油的抗氧化性研究較多。王媛等（2012）研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽油的濃度大于25 mg/mL時，其對DPPH清除率最大，為80.70%;胡翠珍等（2015）研究葡萄籽油對羥基自由基的清除率，發(fā)現(xiàn)當濃度為140 μg/mL時，葡萄籽油對羥基自由基的清除率最高，達80.00%。本研究對桂桑優(yōu)12種子油的抗氧化活性進行分析，結果表明，桂桑優(yōu)12種子油對DPPH和羥基自由基均具有較強的清除能力;隨著桂桑優(yōu)12種子油質量濃度的不斷增大，其抗氧化能力逐漸增強;桂桑優(yōu)12種子油對DPPH和羥基自由基的IC50分別為2.111和0.196 mg/mL。相比之下，桂桑優(yōu)12種子油清除DPPH能力較葡萄籽油更強，可為桂桑優(yōu)12種子油的開發(fā)利用和廣西桑樹資源多元化發(fā)展提供參考依據(jù)。

4 結論

結合單因素試驗和響應面試驗設計，可較好地優(yōu)化桂桑優(yōu)12種子油提取工藝，優(yōu)化后的工藝具有操作便捷、高效可行的優(yōu)勢，所提取的種子油具有較強抗氧化能力。

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（責任編輯 羅 麗）