孟文俊 張愛麗 蔣樂曉 朱文杰 段麗 錢子剛

摘?要：金鐵鎖是 “云南白藥”等多種中成藥的重要組成，其有效成分為三萜皂苷，MYC類轉錄因子在調節(jié)植物三萜類次生代謝積累中有重要作用。為研究ptMYC2 基因在金鐵鎖三萜皂苷合成代謝途徑的調控機制，該研究基于金鐵鎖轉錄組測序數(shù)據(jù)，克隆得到ptMYC2轉錄因子的兩個全長基因;通過生物信息學軟件對兩條轉錄因子的同源性、理化性質、疏水性、跨膜結構、亞細胞定位、結構域、靶基因結合位點等進行初步預測分析。結果表明：兩條轉錄因子所編碼的蛋白屬于親水性蛋白，不存在跨膜區(qū)域，均是非分泌蛋白質，且不存在信號肽;兩條轉錄因子的亞細胞定位于細胞核;結構域分析顯示，兩個基因都含有bHLH家族結構域;預測得到金鐵鎖三萜皂苷合成途徑中HMGR、FPS、SE、β-AS等基因的啟動子可能存在與MYC2結合的E-box特異性結合位點。該研究結果將為進一步研究ptMYC2基因在金鐵鎖三萜皂苷合成代謝途徑的調節(jié)機制奠定基礎。

關鍵詞： 金鐵鎖， 轉錄因子， MYC2， 三萜皂苷， 生物合成途徑， 生物信息學分析

MENG Wenjun， ZHANG Aili， JIANG Lexiao， ZHU Wenjie， DUAN Li ， QIAN Zigang*

（ Certer for Reproducing Fine Varieties of Chinese Medicinal Plants， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China ）

Abstract：Psammosilene tunicoides is an important component of various Chinese patent medicines such as “Yunnan Baiyao”， and its active ingredient is triterpenoid saponin. MYC2 is an important transcription factor， which plays an important role in regulating the secondary metabolic accumulation of triterpenoids in plants. In this study， we cloned two transcription factors（ ptMYC2-1 and ptMYC2-2 ） of Psammosilene tunicoides based on transcriptome sequencing. Meanwhile， the homology， physical and chemical parameters， hydrophobicity， transmembrane helices， subcellular location， domain， target gene binding site were predicted through bioinformatics software. The experimental results showed that the proteins encoded by the two transcription factors belonged to the hydrophilic protein and did not exist the transmembrane region， and both of them were non-secreted proteins， and without signal peptide. The subcellular of two transcription factors localizes to the nucleus. Domain analysis revealed that both genes contained the bHLH family domain. We predicted that the promoter of these genes（ HMGR， FPS， SE and β-AS）， which involved the triterpenoid saponin synthesis pathway of Psammosilene tunicoides， contained the E-box binding domain. This study provides the basic information for stu-dying the regulatory mechanisms of the ptMYC2 gene in the metabolic pathway of triterpenoid saponins.

Key words： Psammosilene tunicoides， transcription factor， MYC2， triterpenoid saponin， biosynthetic pathway， bioinformatics analysis

金鐵鎖（Psammosilene tunicoides）是云南道地的瀕危藥用植物，是“云南白藥”等多種中成藥的重要組成。其活性成分是齊墩果烷型三萜皂甙，具有顯著的鎮(zhèn)痛和抗炎等藥理活性（Zhang et al.，2012）。由于其顯著的藥理活性，該藥藥用資源已開始匱乏。因此，揭示相關轉錄因子在金鐵鎖三萜皂苷合成途徑的調控機制，定向增加金鐵鎖三萜皂苷的積累，顯得尤為重要。

茉莉酸（JAs）是植物中重要的植物激素（包括JA及其甲酯衍生物MeJA），它是植物響應生物或非生物脅迫的重要信號轉導分子（Devoto & Turner，2010;王云鋒等，2019）。其通過在次生代謝過程中調節(jié)相關酶基因，可以合成次生代謝產物，如類黃酮和萜類化合物，從而提高植物的抗逆性。其中MYC2轉錄因子是茉莉酸（JAs）信號途徑中的重要轉錄因子，其可以通過和靶基因的啟動子結合，調節(jié)下游基因的表達（Nims et al.，2009）。當植物處于正常狀態(tài)下，植物體內的核蛋白JAZ（Jasmonate-ZIM Domain）及一些共同抑制物（如TOPLESS或TPL-related proteins TPLs）能夠抑制JA信號途徑中的轉錄因子，使其不能正常和靶基因的啟動子結合，從而抑制轉錄因子激活下游基因的表達（Chini et al.，2007）。相反，當植物受到脅迫時，JA可以與異亮氨酸共軛以形成茉莉酸異亮氨酸共軛物JA-Ile。 JA-Ile具有一定的生物活性，能使 JAZ蛋白與 Skp1/ Cullin1/ F-box protein COI1（ SCF COI1）形成共軛復合體，該復合物被26 S蛋白酶降解，其釋放轉錄因子并調節(jié)下游應激基因的表達，促進次生代謝產物的積累（Thines et al.，2007）。目前，已有一些關于MYC2轉錄因子調節(jié)植物次生代謝產物合成的研究報道，如煙草中尼古丁的合成需要NtMYC2的參與，NtMYC2a和NtMYC2b可與抑制因子NtJAZ1形成核配合物，并調節(jié)茉莉酸誘導的尼古丁生物合成的多個步驟（Zhang et al.，2012）。 Hong et al.（2012）發(fā)現(xiàn)MYC2通過直接結合到倍半萜合酶TPS21和TPS11的啟動子區(qū)激活表達，調節(jié)萜類合酶基因表達和揮發(fā)性倍半萜的合成。在長春花中，CrMYC2作為早期茉莉酸甲酯響應因子，通過調節(jié)ORCA基因表達進而調控一系列吲哚類生物堿（TIAs） 合成酶基因的表達（Zhang et al.，2011）。但是，對金鐵鎖轉錄因子的研究尚未見有報道。目前，課題組前期已經克隆了金鐵鎖齊墩果烷型三萜皂苷生物合成途徑中多個關鍵酶基因，但轉錄因子對這些基因的轉錄調控機制尚不清楚。鑒于此，本研究克隆了金鐵鎖中相關的ptMYC2基因，并進行了生物信息學分析，預測可能與克隆的ptMYC2相互作用的靶基因。為揭示金鐵鎖三萜皂苷代謝途徑的轉錄因子調控機制奠定一定的基礎。

1?材料與方法

1.1 植物材料

金鐵鎖采集于云南省麗江市，經云南中醫(yī)學院錢子剛教授鑒定為石竹科金鐵鎖屬植物金鐵鎖（Psammosilene tunicoides）。

1.2 主要儀器

高速冷凍離心機（eppendorf）;電泳儀（BIO-RAD 公司）;DYC-33A 微型電泳槽（BIO-RAD 公司）;凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD 公司）; PCR反應擴增儀（BIO-RAD 公司）;移液槍（eppendorf）;常用耗材均購自昆明鼎國生物技術有限公司。

1.3 主要試劑

TaKaRa Minibest Universal RNA Extraction Kit RNA提取試劑盒（TaKaRa生產批號為AK1602）;TaKaRa PrimeScriptTM11st cDNA Synthesis Kit（TaKaRa 生產批號為AK4501 ）反轉錄試劑盒;TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extracyion Kit Ver 4.0割膠回收試劑盒（TaKaRa 生產批號為AK1901）aKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 4.0 質粒提取試劑盒;DL2000 DNA Marker（ TaKaRa 生產批號為A2101A）等。

1.4 方法

1.4.1 引物設計?依據(jù)金鐵鎖轉錄組中調控因子ptMYC2的兩條基因序列分別設計一對擴增引物（表1）。

1.4.2 轉錄因子ptMYC2的克隆?采用總RNA提取試劑盒提取金鐵鎖根中總RNA;采用Takara 的PrimeScriptTM11st cDNA Synthesis Kit試劑盒將總RNA反轉得到第一鏈cDNA，以該cDNA為模板，利用設計的引物進行兩條ptMYC2的全長擴增。其中PCR體系如表2和表3。

經過多次篩選，確定的ptMYC2-1的體系：98 ℃、1 min，98 ℃、10 s，48 ℃、15 s，72 ℃、45 s共32個循環(huán);72 ℃、10 min，4 ℃終止。ptMYC2-2的體系：98 ℃、 1 min，98 ℃、10 s，55 ℃、15 s，72 ℃、45 s共32個循環(huán);72 ℃、10 min，4 ℃終止。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，使用試劑盒（TaKaRa）割膠回收并純化，經過測序得到序列信息。

1.4.3 轉錄因子ptMYC2的T克隆載體構建?將純化后的產物與1 μL PMDTM 18-T vector cloning Kit構建10 μL連接體系，連接后轉化至酵母感受態(tài)細胞中，涂布于LB固體培養(yǎng)基（氨芐青霉素抗性）上，37 ℃溫育培養(yǎng)，后挑單克隆過夜培養(yǎng)，使用質粒提取試劑盒按說明提取質粒，進行PCR驗證后進行測序。

1.4.4 轉錄因子ptMYC2的生物信息學分析?對金鐵鎖的轉錄調控因子ptMYC2的兩個基因進行生物信息學分析。在NCBI（https： //www.ncbi.nlm.nih.gov/） 網站上通過 BLAST程序進行序列同源性比對;使用ORF Finder（https： //www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/ ）尋找其開放閱讀框;通過ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預測蛋白質的理化性質。使用ProtScale（https： //web.expasy.org/protscale/）軟件進行疏水性分析;在TMHMM（http： //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）網站預測蛋白的跨膜區(qū)域;運用在線工具SignalP3.0（http： //www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）服務器進行蛋白質信號肽預測分析;通過TargetP 1.1 Server（http： //www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和Cell-PLoc 2.0（http： / /www. csbio. sjtu. edu. cn/bioinf/Cell-PLoc-2/） 預測蛋白質的亞細胞定位情況;使用 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）軟件對 ptMYC2-1和 ptMYC2-2的保守結構域進行預測;應用在線軟件CFSSP（http： //www.biogem.org/tool/chou-fasman/index.php）對蛋白質的二級結構進行預測。通過SWISS-MODEL（https： //swissmodel.expasy.org/interactive）進行三級結構預測;應用 MEGA 5. 0 軟件構建系統(tǒng)進化樹;在NCBI中使用 Blast來搜索目標基因的相似性，參照最高相似物種的序列搜索該序列的基因組序列，并下載目標基因上游2 000 bp的區(qū)域作為該目標基因的啟動子序列，采用JASPAR2016 server預測可能與ptMYC2互作的靶基因及結合信息位點。

2?結果與分析

2.1 金鐵鎖轉錄因子ptMYC2的克隆

提取金鐵鎖根的總RNA進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的RNA條帶清晰，表明提出金鐵鎖RNA。將RNA反轉為cDNA，PCR擴增后經過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序驗證。將全長構建入T克隆載體，測序后結果表明擴增序列與轉錄組序列基本一致。

2.2 金鐵鎖轉錄因子基因的生物信息學分析

2.2.1 轉錄因子基因同源性分析?通過NCBI Blast進行同源性分析，由結果可知，兩個轉錄因子ptMYC2與其他植物的MYC2轉錄因子具有同源性，根據(jù)結果推測擴增出金鐵鎖ptMYC2-1和ptMYC2-2基因。

2.2.2 轉錄因子基因編碼蛋白質理化性質分析?ptMYC2-1轉錄因子的蛋白理化性質由Protparam在線工具預測后，分析結果顯示ptMYC2-1轉錄因子開放閱讀框1 713 bp，編碼了570個氨基酸;預測分子式為C2779H4407N787O885S23;分子量為6 374.68;理論等電點為6.06;在組成的氨基酸當中，絲氨酸（Ser）占比達11.4%，相對較高;不穩(wěn)定參數(shù)為47.66，推測ptMYC2-1蛋白為不穩(wěn)定蛋白; 脂肪族指數(shù)為76.91。使用相同的方法來預測ptMYC2-2轉錄因子的理化性質，ptMYC2-2的開放閱讀框長度為1 902 bp，轉錄因子編碼663個氨基酸;推測蛋白質分子式為C3018H4763N863O972S20;分子量為69 330.42;理論等電點為5.33;在組成的氨基酸當中，也是絲氨酸（Ser）占比最高，達到10.6%;不穩(wěn)定參數(shù)為52.4，推測ptMYC2-2 的蛋白為不穩(wěn)定的蛋白;脂肪指數(shù)為70.88。

2.2.3 轉錄因子基因編碼蛋白質的疏水性分析?采用 ProtScale 對金鐵鎖轉錄因子ptMYC2-1和ptMYC2-2的氨基酸序列的疏水性/親水性進行分析，從結果可知 （圖1，圖2）， 在379 bp左右位置ptMYC2-1蛋白有一個典型的親水性區(qū)域;在89 bp左右位置ptMYC2-2蛋白有一個典型的親水性區(qū)域。

2.2.4 轉錄因子基因編碼蛋白質的跨膜區(qū)分析?通過TMHMM2.0對兩個轉錄因子進行蛋白跨膜結構分析，預測結果顯示，這兩個基因編碼的蛋白均不存在跨膜區(qū)域，都不屬于跨膜蛋白。

2.2.5 轉錄因子基因編碼蛋白質的信號肽、亞細胞定位預測分析?ptMYC2-1 和ptMYC2-2使用 SignalP 3. 0 軟件進行信號肽預測，從神經網絡模型分析，可以判斷兩種蛋白質都沒有信號肽。隱馬爾福模型進一步證實，金鐵鎖ptMYC2-1和ptMYC2-2編碼的蛋白質均是非分泌蛋白質，并且不存在信號肽。由在線細胞定位分析工具TargetP1.1服務器分析ptMYC2-1和ptMYC2-2編碼的蛋白的定位情況，結果顯示都定位在其他細胞器，再由Cell-PLoc 2.0進行具體定位分析，兩個因子均定位在細胞核。

2.2.6 轉錄因子基因結構域分析?使用 SMART軟件對 ptMYC2-1和 ptMYC2-2的保守結構域進行預測，結果得知ptMYC2-1從39到218位置之間存在一個高度保守的結構功能域 bHLH（圖3）。ptMYC2-2從 28到 208位置之間存在一個高度保守的結構功能域bHLH（圖4）。即 bHLH家族成員共有的典型結構域。

2.2.7 轉錄因子基因編碼蛋白質的二級結構及三級結構預測?通過二級結構在線預測軟件CFSSP對ptMYC2-1和ptMYC2-2分別進行分析，結果如下圖所示，ptMYC2-1編碼蛋白二級結構中，α-螺旋（H）占70%，β折疊（E）占57.2%，轉角（T）占14.0%。ptMYC2-2編碼蛋白二級結構中，α-螺旋（H）占65.9%，β折疊（E）占51.3%，轉角（T）占14.4%。兩個基因編碼的蛋白質的二級結構均是混合型。以擬南芥 AtMYC2蛋白（登錄號 NM-102998.3）為參比模板，利用 SWISS-MODEL對 ptMYC2-1和 ptMYC2-2的蛋白質三維立體結構進行預測。結果如下圖所示（圖5、圖6和圖7），金鐵鎖ptMYC2蛋白的bHLH區(qū)域與擬南芥AtMYC2蛋白的bHLH區(qū)域結構結構相似。相同bHLH和不同bHLH轉錄因子的α-螺旋之間可以相互作用，形成同源或異源二聚體從而與靶基因啟動子的不同部位結合，發(fā)揮轉錄調控作用。

2.2.8 轉錄因子基因系統(tǒng)進化樹的構建?將金鐵鎖 ptMYC2-1和ptMYC2-2與 GenBank 數(shù)據(jù)庫中多種植物的轉錄因子進行比對分析后，選取相似性高的植物的MYC2轉錄因子，利用 MEGA 5. 0中的 Neighbor-Joining 方法，構建系統(tǒng)進化樹。結果表明ptMYC2-1與藜麥的MYC2親緣關系接近（圖8）。ptMYC2-2也與藜麥中的MYC2 親緣關系接近（圖9）。由于藜麥屬于藜科，金鐵鎖屬于石竹科，藜科與石竹科均屬于較原始的類群，親緣關系較近，所以本研究克隆得到的金鐵鎖ptMYC2與藜麥的cqMYC2聚為一類。

2.2.9 轉錄因子與靶基因結合位點信息分析?MYC類轉錄因子對目的基因的調控，是通過與目的基因啟動子的E-box特異性結合域的結合實現(xiàn)的。由于金鐵鎖還未進行過全基因組測序，本研究通過Blast軟件對金鐵鎖三萜皂苷合成途徑上的關鍵酶基因HMGR、SE、FPS、β-AS分別進行相似性搜索，其中，金鐵鎖HMGR的基因序列與胡楊（Populus euphratica）的相似性最高，SE1與甜菜 （Beta vulgaris subsp.）的相似性最高，SE2、FPS、β-AS的序列與藜麥（Chenopodium quinoa）的相似性最高，分別下載相似性最高物種基因上游2 000 bp的區(qū)域作為該基因的啟動子序列（啟動子序列見附錄），分析預測可能與ptMYC2互作的靶基因及結合信息位點，結果如表4所示。

3?討論

金鐵鎖是西南地區(qū)的珍稀瀕危藥材， 為多種著名中成藥的重要組成，其有效成分為五環(huán)三萜皂苷。由于其顯著的藥理活性，金鐵鎖資源遭到大量的挖掘破壞，已處于瀕危狀態(tài)，目前已被IUCN收錄為瀕危種。MYC類轉錄因子是植物茉莉酸類激素響應途徑中的核心轉錄因子，近年來，在煙草（Zhang et al.，2012）、擬南芥（Hong et al.，2012）、長春花（Hedhili et al.，2010）、紅豆杉（Lenka et al.，2015）等植物中克隆得到的MYC2轉錄因子，研究發(fā)現(xiàn)其都參與調節(jié)了次生代謝產物的合成。在發(fā)現(xiàn)的眾多MYCs轉錄因子中，MYC2是研究較多的一類轉錄因子。鑒于此，本研究開展對金鐵鎖轉錄因子ptMYC2的研究，以期能夠獲得參與金鐵鎖有效成分調控的ptMYC2轉錄因子，為后期完成金鐵鎖有效成分的定向積累奠定基礎。

本研究克隆得到兩條具有完整開放閱讀框ORF的ptMYC2轉錄因子，ptMYC2-1與 ptMYC2-2的 ORF長度分別為1 713 bp和1 902 bp，分別編碼570個和633個氨基酸殘基，分子量為63.75 kD和69.33 kD。 通過SMART軟件分析，ptMYC2-1與ptMYC2-2都存在一個高度保守的結構功能域bHLH，具有bHLH家族成員共有的典型結構域。從三級結構預測圖可以看出，所獲得的兩條ptMYC2基因與擬南芥的AtMYC2有相似的三級結構，都具有bHLH家族共有的α螺旋1-環(huán)-α螺旋2（ helix-loop-helix）保守結構域，該 helix-loop-helix結構可以與靶基因啟動子相結合，從而發(fā)揮對基因的調控作用（Stevens et al.，2010）。同時，將該兩條序列與其他氨基酸序列進行BlastX同源比對發(fā)現(xiàn)，本研究克隆得到的兩條MYC2編碼的蛋白與煙草（Nicotiana tabacum）的NtMYC2編碼蛋白同源性在50%以上，煙草中該轉錄因子主要是參與調控了煙草中尼古丁的生物合成（Zhang et al.，2012），故推測該兩條ptMYC2轉錄因子也可能與金鐵鎖次生代謝產物的調控有關。

MYC2轉錄因子主要是通過與目的基因DNA的結合來調控基因的表達。而這些與目的基因的特異性結合區(qū)域，一般都存在于目的基因的啟動子上（沈乾等，2012）。因此，預測MYC2啟動子與靶基因的特異性結合區(qū)域是研究轉錄因子調控的前提。bHLH蛋白可分為A，B，C，D，E和F，這取決于bHLH的基本DNA結合模式。B類 bHLH可與具有5′-CACGTG-3′特征的E-box結合，其中包括 MYC家族（Ledent & Vervoort，2001）。因此，本研究以E-box作為結合片段，選取課題組前期研究三萜皂苷合成途徑中的幾個關鍵酶基因作為靶基因，通過Blast軟件對這些關鍵酶基因進行相似性搜索，以搜索到的相似性最高的物種為參考，選取參考基因上游2 000 bp作為啟動子，分析與ptMYC2靶基因的結合信息位點。預測結果顯示，金鐵鎖三萜皂苷合成途徑中的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A 還原酶（HMGR）、鯊烯環(huán)氧酶（SE）、法尼基焦磷酸合成酶（FPS）、β-香樹素合酶（β-AS）等基因啟動子中都有可能具有E-box的特異結合位點，ptMYC2轉錄因子有可能與這些基因互作從而對其進行調控。沈乾等（2016）在對青蒿MYC類轉錄因子的研究中發(fā)現(xiàn)，轉錄因子AaMYC2能與青蒿素生物合成途徑中的P450基因CYP71AV1和DBR2基因的啟動子結合，進而參與調控青蒿素的生物合成過程。本研究通過對ptMYC2與靶基因結合位點的預測分析，為后續(xù)開展的實驗提供了豐富的基因資源。

綜上所述，本研究克隆得到了兩條ptMYC2轉錄因子，并對其進行生物信息學分析，為后期即將開展的酵母雙雜等驗證該兩條轉錄因子功能的實驗提供了科學依據(jù)。

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