王鋮博 陳樂樂 焦彩珍 石繼鵬 慕星星 張繼

摘?要：陜甘花楸（Sorbus koehneana）是我國西北地區(qū)特有的灌木之一，主要被用于觀賞和制作家具，但對其有效成分的研究卻鮮見報道，從而限制了陜甘花楸產(chǎn)業(yè)的進一步開發(fā)和利用。該研究以陜甘花楸果實為原料，經(jīng)石油醚脫脂后，采用超聲輔助水提醇沉法提取、Sevag法脫蛋白，得到了較純的花楸果實多糖（SSP），并對其進行結構表征和抗氧化活性研究。結果表明：（1）經(jīng)苯酚-硫酸法測得多糖純度為65.8%;FT-IR檢測官能團，發(fā)現(xiàn)在3 420 cm-1、2 929 cm-1和1 733 cm-1處存在多糖的典型吸收峰;用SEC-LLS測得重均分子量（Mw）為1.739×105，數(shù)均分子量（Mn）為5.052×104，多分散系數(shù)為3.443，表明分子量分布較為均一;經(jīng)三氟乙酸酸解、糖腈衍生化等處理及氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法測定SSP的單糖組成，表明SSP由甘露糖、葡萄糖和未知單糖等3種單糖組成，摩爾比為2.2∶1.4∶6.4。（2）體外抗氧化活性實驗表明：SSP具有很好的DPPH清除活性、超氧陰離子清除活性以及較強的還原力;當SSP濃度為2 mg·mL-1時，SSP對DPPH自由基的清除能力相當于BHT的96%，對超氧陰離子自由基清除能力為Vc的76.07 %，還原能力等價于Vc的92%。以上表明該多糖可以用于抗衰老和抗炎等方面，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，為花楸資源的進一步開發(fā)利用提供了更為廣闊的前景。

關鍵詞：陜甘花楸， 多糖， 提取純化， 結構表征， 抗氧化活性

中圖分類號：Q946.3

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）11-1527-07

Abstract：Sorbus koehneana is one of the shrubs peculiar in Northwest China. It is mainly used for ornamental and making tools. The research on its effective components is rarely reported， which limits the further development and utilization of the industry of S. koehneana. The polysaccharide components in the fruit of S. koehneana were extracted， and their structures and antioxidant activities were studied.?Take S. koehneana fruit as materials， use ultrasonic assisted water extraction and alcohol precipitation， and sevage method to remove protein. Thus， we obtained the S. koehneana fruit polysaccharide（SSP）. The results were as follows：（1） The polysaccharide content detected by phenol-sulfuric acid method was 65.8%. The functional group was detected by FT-IR and the polysaccharide was observed to have three characteristic peaks of sugar at 3 420 cm-1， 2 929 cm-1 and 1 733 cm-1， whose molecular weight（Mw） was detected by the SEC-LLS was 1.739×105， number average molecular weight（Mn） was 5.052×104 and the polydispersity was 3.443， and uniform molecular weight distribution. Acidolysis of polysaccharides with trifluoroacetic acid， hydroxylamine hydrochloride and acetic anhydride were derivatized. The monosaccharide composition of S. koehneana polysaccharides was determined by GC-MS， and the polysaccharides were composed of three kinds of monosaccharides such as mannose， glucose and unknown monosaccharide， and the molar ratio was 2.2∶1.4∶6.4.（2） The antioxidant activity tests in vitro showed that the SSP had high scavenging capacity on DPPH， superoxide anion radicals and reducing power. The scavenging capacity of SSP on DPPH radical was 96% of BHT， 76.07% of Vc on superoxide anion radical and 92% of Vc on reduction， while the concentration of SSP was 2 mg·mL-1. Through this study， we can not only provide theoretical basis for the efficient extraction of polysaccharides from S. koehneana fruits， but also provide a broader prospect for the further development and utilization of S. koehneana resources.

Key words：Sorbus koehneana， polysaccharide， extraction and purification， structural characterization， antioxidant activity

花楸（Sorbus pohuashanensis），為薔薇科蘋果亞科花楸屬。果實為圓形，顏色為紅色，結實期為9—10月（Li et al.， 2012）。研究表明，花楸屬植物有抗氧化、抗癌、治療炎癥、護肝等功能，花楸果實具有利尿、治療心血管疾病等功能（Li， 2011; Termentzi et al.， 2006）。陜甘花楸（S. koehneana）是花楸屬植物的一個種，果實中富含多種生物活性物質(zhì)，如多糖、維生素、蛋白質(zhì)和膳食纖維等（Li et al.， 2012）。

多糖是其中重要的一種生物活性物質(zhì)，由于其具有抑制腫瘤細胞生長、抗氧化、抑菌、防輻射、保護心血管、調(diào)節(jié)機體免疫力、清除自由基等活性（王運強，2009; Chen et al.， 2015; Liu et al.， 2018），且綠色安全，已引起人們的廣泛關注（徐雅琴等，2017）。

董成國（2016）研究表明，可以采用超聲波輔助水提法，這是由于在超聲波傳播的過程中，能夠作用于提取液，產(chǎn)生空化效應、熱效應和機械效應，其中以空化效應為主，會導致植物細胞壁發(fā)生破裂，從而釋放目標產(chǎn)物到提取液中，有利于提高多糖的得率。在多糖的結構表征研究中，常使用FT-IR檢測樣品含有的官能團，初步鑒定樣品是否為多糖類物質(zhì);通過對多糖物質(zhì)的酸解及乙?；幚恚褂肎C-MS來檢測其單糖組成;多糖的生物活性與分子量有很大的關系，所以采用SEC-LLS來測定多糖物質(zhì)的分子量及分散系數(shù)。人體在生命活動過程中，會產(chǎn)生大量的自由基，自由基的存在會造成組織和細胞的巨大損傷，加速機體的衰老，許多疾病的發(fā)生和發(fā)展都與氧化損傷存在很大的關系，如心血管疾病和癌癥等（Hu et al.， 2010）。目前合成的化學抗氧化藥物均有一定的副作用，因此，尋找高效低毒的天然抗氧化劑具有重要的研究意義。

1?材料與方法

1.1 材料

所用材料采自甘肅省蘭州市石佛溝國家森林公園，海拔2 800～3 000 m的小溪邊陰坡，野生，經(jīng)西北師范大學生命科學學院令利軍副教授鑒定為薔薇科花楸屬陜甘花楸（Sorbus koehneana），標本編號2016-07-15-010。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 主要儀器?KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;UV 9100b紫外-可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）;LGJ-18S真空冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）;Nicoletis10傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo公司）;體積排阻色譜-光散射聯(lián)用（SEC-LLS）;Polaris Q-Focus GC氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo公司）。

1.2.2 試劑?溴化鉀（天津市光復精細化工研究所）;石油醚（煙臺市雙雙化工有限公司）;DPPH（西安熱默爾生物科技有限公司）;BHT（淄博祥東化工有限公司）;Vc（太原永耀生物科技有限公司）;NBT（上海滬宇生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 陜甘花楸果實多糖（SSP）的提取、分離和純化?將陜甘花楸果實晾干，粉碎過100目篩，以石油醚作為脫脂溶劑，使用索氏提取器進行脫脂處理。取50 g脫脂花楸粉，按料液比1∶20加入蒸餾水，超聲輔助提?。ǘ蓢?，2016）。提取溫度60 ℃，功率200 W，提取時間1 h。提取液4 000 r·min-1離心10 min，收集上清。重復提取一次，合并上清液，濃縮。80%乙醇醇沉。離心收集沉淀即得花楸果實粗多糖。粗多糖復溶，按4∶1的比例加入Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），重復多次，直至紫外光260～280 nm范圍沒有吸收峰（郭元亨等，2018）。脫蛋白處理后的粗糖液冷凍干燥，即得花楸果實多糖（SSP）。

1.3.2 多糖含量的測定?使用苯酚-硫酸法在490 nm處測定吸光值，以葡萄糖作標準曲線，計算多糖含量（Liu et al.， 2018）。

1.3.3 紅外光譜（FT-IR）分析?SSP的紅外光譜分析采用KBr壓片法。取充分干燥的花楸果實多糖樣品，按KBr∶樣品=100∶1的比例進行壓片。使用FT-IR在4 000～400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)掃描16次，分辨率4 cm-1（王小江等，2017）。

1.3.4 分子量測定?參照殷軍（2013）使用的方法，并略作修改。樣品分子量采用體積排阻色譜-光散射聯(lián)用（SEC-LLS）進行測定。檢測器為多角度激光光散射儀（DAWN Eos， Wyatt Technology Co.， USA），λ=690 nm;色譜柱為UltrahydrogelTM column（7.8 mm×300 mm， Waters， USA）;示差折光檢測器（DAWN Eos， Wyatt Technology Co.， USA）。檢測樣品濃度為2.0 mg·mL-1，樣品檢測前經(jīng)孔徑為0.2 μm過濾器過濾。

1.3.5 單糖組成分析?用GC-MS研究單糖組成，參考劉琴等（2014）的方法。

花楸果實多糖酸解：準確稱取20 mg花楸果實多糖，加入4 mL 4 mol·L-1三氟乙酸，并在氮氣保護條件下油浴120 ℃處理10 h后，減壓濃縮蒸干其中的三氟乙酸。

柱前衍生化：向減壓蒸干后的多糖樣品中，加入10 mg鹽酸羥胺和1 mL吡啶，氮氣保護90 ℃反應30 min，待冷卻后，向反應體系中加入1 mL乙酸酐進行乙?；幚?，氮氣保護下90 ℃反應30 min。減壓蒸干后加入1 mL氯仿溶解，無水硫酸鈉脫水過0.22 μm微孔濾膜，待氣質(zhì)分析。

氣相色譜條件：TR-5ms SQC色譜柱（30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm），升溫條件：從120 ℃（保持3 min）開始，以5 ℃·min-1升溫至250 ℃保持5 min。載氣為高純氦氣（He），柱流量為1.0 mL·min-1，分流比為1∶50，進樣口溫度250 ℃，進樣量0.2 μL。

質(zhì)譜（MS）條件：電離方式為電子電離（electron ionization， EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃，四極桿150 ℃，掃描質(zhì)量范圍為33～550 m·z-1，無溶劑延遲。

標準單糖處理方法和GC-MS條件同上。

1.3.6 DPPH自由基清除活性測定?精確稱取SSP和BHT配制濃度為0.2、0.6、1.0、2.0 mg·mL-1的溶液。在SSP組和BHT組中分別加0.5 mL 2.0×10-4 mol·L-1的DPPH，遮光靜置0.5 h，517 nm下測得Ai。吸取不同濃度待測多糖溶液以及BHT溶液2 mL，加入0.5 mL蒸餾水，測得Aj。0.5 mL DPPH溶液中加等體積的蒸餾水，測得A0，重復3次求平均值（Cheng & Kan， 2017）。計算公式如下：

DPPH清除率=（1-Ai-AjA0）×100%。

1.3.7 超氧陰離子清除活性測定?精確稱取SSP和Vc配制濃度為0.2、0.6、1.0、2.0 mg·mL-1的溶液。取1 mL 4種梯度的SSP溶液和Vc溶液，分別加濃度為557 μmol·L-1 NADH-2Na、45 μmol·L-1 PMS及108 μmol·L-1 NBT各1mL，混勻后，于25 ℃反應5 min，510 nm下測得Ai。以蒸餾水為對照，測得A0，重復三次求平均值（Li et al.， 2006）。計算公式如下：

超氧陰離子清除率=（1-AiA0）×100%。

1.3.8 還原力測定?參照于學海等（2014）使用的方法并略作修改。SSP與Vc配制濃度為0.02、0.06、0.1、0.2、0.6、1、2 mg·mL-1的溶液。各取1 mL 7種濃度的多糖溶液和Vc溶液依次加入磷酸緩沖液（pH 6.6）和鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]溶液（質(zhì)量分數(shù)為1%）各2.5 mL，混勻后50 ℃水浴20 min，然后加入三氯乙酸溶液（質(zhì)量分數(shù)為10%）2.5 mL，混勻，1 000 r·min-1離心10 min，取上清液2.5 mL，再加入蒸餾水和氯化鐵（FeCl3，質(zhì)量分數(shù)0.1%）各2.5 mL，混勻，靜置10 min，蒸餾水調(diào)零，在700 nm處測定吸光值，每個樣品重復3次，以700 nm吸光值的平均數(shù)表示還原力的高低。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件的ANOVA方法對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗分析，以P<0.05為差異顯著，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（x±s）。

2?結果與分析

2.1 SSP的提取與純化

經(jīng)苯酚-硫酸法測得梯度葡萄糖的吸光值，得到標準曲線?；貧w方程：Y=16.238 54X-0.043 85，R2=0.999 06。式中，Y為吸光度，X為濃度。測得SSP純度為65.8%。

2.2 紅外光譜分析

紅外光譜是定性鑒定多糖結構的基本方法，根據(jù)紅外光譜中各特征峰的位置和性狀可以推斷出多糖結構的特征。圖1為 SSP在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)的紅外吸收光譜。表現(xiàn)出典型的多糖吸收峰。其中，波數(shù)3 420.47 cm-1處的大而寬的吸收峰為分子量羥基（-OH）的伸縮振動峰（Chen et al.， 2018）;2 929.51 cm-1處的肩峰是亞甲基（-CH2）中C-H鍵的伸縮振動峰（封燕等，2016）;1 733.57 cm-1處的吸收峰是醛基（-CHO）的C=O伸縮振動峰（Wang et al.， 2018）;1 616.58 cm-1和1 436.50 cm-1左右處的吸收峰對應的可能是C-H 鍵伸縮振動峰和=CH2的變形特征峰（張逸等，2017）;1 100.49 cm-1處是吡喃糖環(huán)的特征吸收峰，表明該糖為吡喃糖（封燕等，2016）。

2.3 分子量測定

采用SEC-LIS法測定SSP的分子量，軟件分析可知，SSP重均分子量（Mw）為1.739×105，數(shù)均分子量（Mn）為5.052×104，多分散系數(shù)（Mw·Mn-1）為3.443，說明其分子量分布較為均一。

2.4 單糖組成分析

通過對7種標準單糖和SSP樣品先后進行氣質(zhì)分析，由圖2：B得知，陜甘花楸果實多糖在此色譜下分離完全，有主要的三個峰。與混合標準單糖的色譜圖（圖2：A）對照，SSP由3種單糖組成，

分別為甘露糖、葡萄糖與未知單糖。26.46 min處的單糖由于缺少相應單糖標品，暫時未分析出來。通過峰面積之比得出，三種單糖的摩爾比為2.2∶1.4∶6.4。

2.5 DPPH自由基清除活性測定

DPPH（二苯代苦味酰自由基）在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，在517 nm附近有強吸收峰（呈深紫色）。當自由基清除劑存在時，DPPH的孤對電子被配對，其517 nm吸收消失或減弱，通過測定吸收減弱的程度，可評價自由基清除劑的活性。

SSP對DPPH自由基的清除作用見圖3。加入SSP后可以顯著作用于DPPH自由基的清除，并且這種清除能力隨著SSP濃度的升高（0.2～2 mg·mL-1）而增強，呈現(xiàn)一定的量效關系。以BHT

對DPPH自由基的清除能力為參考，對應的每個濃度下，SSP對DPPH自由基的清除能力均小于BHT。但當濃度為2 mg·mL-1時，SSP對DPPH自由基的清除能力相當于BHT的96%。結果表明SSP是一種可以有效清除DPPH自由基的抗氧化劑。

2.6 超氧陰離子自由基清除活性測定

超氧陰離子自由基是活性氧的一種，在體內(nèi)由過氧化物歧化酶清除。在自氧化體系當中釋放出的高毒性超氧陰離子經(jīng)過一系列反應生成其他氧自由基，通過損傷重要的生物大分子來誘發(fā)許多疾病。

SSP對超氧陰離子自由基的清除作用見圖4，加入SSP處理后可以顯著作用于超氧陰離子自由基的清除，且清除活性隨SSP濃度的升高（0.2～2 mg·mL-1）而增強。以Vc對超氧陰離子自由基的清除能力為參照，對應的每個濃度下，SSP對超氧陰離子自由基的清除活性均低于Vc，但在2 mg·mL-1的濃度下，SSP對超氧陰離子自由基的清除活性相當于Vc的76.07%。結果表明，SSP有較強的超氧陰離子自由基清除活性，且活性隨著濃度的增加而增加。

2.7 還原力測定

還原力是測定抗氧化劑活性的重要指標之一，通過測定體系中Fe3+-Fe2+的轉化程度來確定多糖的還原能力強弱。

SSP的還原力可由圖5得出，在0.02～2 mg·mL-1范圍內(nèi)，SSP隨濃度變大，還原能力呈上升趨勢。以Vc的還原力強弱作為對照，在對應的每個濃度梯度下，SSP的還原能力均低于Vc。當濃度為2 mg·mL-1時，SSP的還原能力為Vc的92%。結果表明，SSP有較好的還原力，其還原力隨著濃度的增大而增大。

3?討論與結論

本研究結合西北特有且研究較少的特色資源，研究了陜甘花楸（Sorbus koehneana）果實多糖的化學結構（單糖組成及其摩爾比、分子量、官能團的種類），并從體外水平考察花楸多糖對氧化損傷的保護能力。

花楸果實多糖（SSP）主要經(jīng)超聲輔助水提醇沉法提取，石油醚索氏提取法脫脂，Sevage法脫蛋白純化，苯酚-硫酸法測純度為65.8%。FT-IR檢測3 420.47 cm-1、2 929.51 cm-1及1 733.57 cm-1處有顯著的多糖特征吸收峰，1 100.49 cm-1處吸收峰表明SSP具有吡喃類多糖;GC-MS及GPC結果表明SSP是由甘露糖、葡萄糖及另外一種未知單糖組成，摩爾比為2.2∶1.4∶6.4，重均分子量（Mw）為1.739×105的一種雜多糖。

研究指出，機體的許多功能障礙和疾病的發(fā)生都與氧化損傷有關，例如神經(jīng)退行性疾?。╪eurodegenerative disease）、腫瘤（tumour）、心血管疾病（cardiovascular diseases）和炎癥（inflammation）等。因此，開發(fā)研究高效低毒的天然抗氧化劑用于這些疾病的預防和治療是國內(nèi)外研究的熱點。多糖是生物體內(nèi)的一種生物活性大分子，在抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和防輻射等方面發(fā)揮著重要的作用。多糖一般通過兩個途徑發(fā)揮其抗氧化活性：一是直接清除體內(nèi)的自由基;二是通過增強生物體內(nèi)抗氧化酶的活性，從而達到清除自由基的作用（劉孝平等，2019;張偉豪等，2018）。常以DPPH自由基清除活性、超氧陰離子自由基清除活性和還原力測定來評定其抗氧化能力。因此，本研究探究了以上幾個指標測定SSP的抗氧化能力強弱。體外抗氧化實驗結果表明當SSP濃度為2 mg·mL-1時，SSP對DPPH自由基的清除能力相當于BHT的96%，對超氧陰離子自由基清除能力為Vc的76.07%，還原能力等價于Vc的92%。以上結果均證實SSP具有較強的抗氧化活性，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑。

陜甘花楸作為西北地區(qū)特有的植物資源，對其研究開發(fā)仍然不夠，其中有效成分得不到很好的開發(fā)利用，因此本研究立足于陜甘花楸，對其果實中生物活性物質(zhì)多糖進行了結構表征及抗氧化活性的研究。 通過本研究，可以為陜甘花楸的進一步開發(fā)利用提供理論指導，并為抗氧化新型制劑的開發(fā)提供了一定的科學依據(jù)。陜甘花楸不僅可作為觀賞植物和制作家具，還可提取開發(fā)其中的有效成分，如多糖、蛋白質(zhì)、黃酮和生物堿等生物活性物質(zhì)，根據(jù)其所具有的生物活性進行天然抗氧化、抗腫瘤等藥物和保健產(chǎn)品的開發(fā);而在抗氧化新型制劑的開發(fā)中，不僅可以將陜甘花楸多糖以滴丸、壓片和顆粒的形式制備成抗氧化藥物，也可與絲素蛋白結合制作成面膜等抗氧化產(chǎn)品，以達到預防氧化損傷疾病的目的。

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