張海全 黃勤英 鄭廣進 曾振芳 許丹妮 農(nóng)克良

摘?要：該研究將小鼠隨機分成正常組，模型組，羅漢果多糖低、中、高劑量組（25、50、100 mg·kg-1）和左旋咪唑組，采用腹腔注射環(huán)磷酰胺（20 mg·kg-1）建立免疫抑制小鼠模型，連續(xù)灌胃給藥14 d后，測定各組小鼠的免疫器官指數(shù)、廓清指數(shù)（K）、吞噬指數(shù)（α）、T和B淋巴細胞增殖水平、耳腫脹度、半數(shù)溶血值（HC50）以及免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α的含量，并觀察脾組織病理形態(tài)變化，考察羅漢果多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響。結(jié)果表明：羅漢果多糖各劑量組（25、50、100 mg·kg-1）均能顯著提高免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)、半數(shù)溶血值（HC50）、B淋巴細胞增殖能力，明顯降低耳腫脹度，顯著增加IgG、IgM、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α的含量。羅漢果多糖中、高劑量組（50、100 mg·kg-1）能顯著增強T淋巴細胞增殖能力，明顯增加廓清指數(shù)（K）、吞噬指數(shù)（α）。脾組織病理學觀察結(jié)果表明，羅漢果多糖可以減輕免疫抑制小鼠脾臟的病理損傷。這表明羅漢果多糖能明顯增強環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠的免疫功能。

關(guān)鍵詞：羅漢果， 免疫抑制， 小鼠， 環(huán)磷酰胺， 多糖

中圖分類號：Q946.3， R932

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）11-1573-10

Abstract：In order to study the activity of Siraitia grosvenorii polysaccharides（SGP）， specially its immunoregulatory activity， Kunming mice were randomized into six groups， including normal group， model group， SGP groups（25， 50， 100 mg·kg-1） and levamisole group. Mice were injected with cyclophosphamide（20 mg·kg-1） to establish the immunosuppressive model， then all groups of mice were treated for sequential 14 d by giving different dose of SGP. Effects of SGP on immune function of immunocompromised mice was studied by detecting many indices， such as thymus and spleen index， carbon clearance index， phagocytic index. Some indexes liked ear edema， the concentration causing 50% hemolysis（HC50）， the proliferation ability of T cells and B cells， the contents of IgG， IgM， IL-2， IL-4， IL-6 ， TNF-α were also be very important parameters to measure immune function. Histopathological examination of spleen tissue also was observed. We found that SGP groups（25， 50， 100 mg·kg-1） was significantly in improving the thymus and spleen indexes. The concentration causing 50% hemolysis（HC50） was increased effectively. The level activity of serum hemolysin was rising compared to model group. Data also showed that SGP groups（25， 50， 100 mg·kg-1） could significantly reduce ear edema. Experiments showed that the proliferation ability of B cells， the contents of IgG， IgM， IL-2， IL-4， IL-6，TNF-α were improving. SGP middle and high groups（50， 100 mg·kg-1）also could significantly increase the carbon clearance index and phagocytic index， and enhance the proliferation ability of T cells. Spleen tissue damage induced by cyclophosphamide was ameliorated according to the histopathological examination. This indicates that SGP can significantly improve immune function of immunocompromised mice.

Key words：Siraitia grosvenorii， immunodepression， mice， cyclophosphamide， polysaccharides

羅漢果是廣西特色植物，其味甘性涼，為藥食兩用的中藥材，被人們譽為“神仙果”。羅漢果富含多糖、黃酮、維生素、蛋白質(zhì)及多種微量元素等成分（Li et al.，2014），研究表明其具有抑菌（梁碩等，2016）、降血糖（鄭楚等，2011）、抗腫瘤（符毓夏等，2016）等功效。李俊等（2008）研究發(fā)現(xiàn)羅漢果多糖（SGPS1）對正常小鼠具有一定免疫增強作用。王勤等（2001）探討了羅漢果甜甙對小鼠細胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明羅漢果甜甙對環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠的細胞免疫功能具有一定的正調(diào)節(jié)作用。前人的研究表明羅漢果對正常小鼠具有免疫增強作用，但對免疫低下的小鼠是否具有免疫增強作用尚不明確（李俊等，2008;王勤等，2001）。

建立免疫抑制動物模型研究藥物對免疫功能的影響更能說明情況，為更深入研究羅漢果多糖的免疫效果，在前人研究（李俊等，2008;王勤等，2001）的基礎(chǔ)上，本研究采用腹腔注射環(huán)磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，研究羅漢果多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響，為開發(fā)羅漢果多糖提供重要理論依據(jù)，使中藥羅漢果的價值得到更充分利用。

1?材料與方法

1.1 實驗動物與材料

昆明小鼠，SPF級，雌雄各半，體重18～22 g，購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（桂）2014-0001，在恒溫（21～25 ℃）、恒濕（40%～65%）下飼養(yǎng)，自由進食和飲水。

羅漢果購于湘君大藥房，經(jīng)農(nóng)克良教授鑒定為葫蘆科植物羅漢果（Siraitia grosvenorii）的成熟果實，加工方式為新鮮果實采收后晾數(shù)天，低溫干燥，陰涼處存放，質(zhì)量要求符合2015版《中國藥典》的要求;環(huán)磷酰胺（薩恩化學技術(shù)（上海）有限公司，批號為13061215）;鹽酸左旋咪唑（山東仁和堂藥業(yè)有限公司，批號為150702）;2，4-二硝基氟苯（DNFB）（國藥集團化學試劑有限公司）;IgG、IgM、IL-2、IL-4、TNF-α、IL-6 Elisa試劑盒（南京建成生物工程研究所）;刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（上?？道噬锟萍加邢薰荆?。

1.2 實驗儀器

UV-6100S紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）;分析天平（華志科學儀器有限公司）;GL-21M高速離心機（長沙湘儀離心機有限公司）;培養(yǎng)箱（型號Sanyo MCO-15AC，上海復昌科技有限公司）;AMR-100全自動酶標分析儀（杭州奧盛儀器有限公司）;waters1525高效液相色譜;Spectrum 65 型傅里葉紅外光譜儀（美國 Perkin Elmer 公司）。

1.3 方法

1.3.1 羅漢果多糖的制備、紅外光譜分析、單糖組分分析及含量測定

羅漢果多糖制備工藝：羅漢果粉碎過40目篩沸水提取減壓濃縮→醇沉→Sevage法除蛋白質(zhì)→AB-8樹脂和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱分離純化→冷凍干燥→精制羅漢果多糖。羅漢果多糖經(jīng)KBr壓片后進行紅外光譜掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1。采用王海英等（2015）的色譜條件，運用 PMP 柱前衍生高效液相色譜法測定羅漢果多糖的單糖組成。采用苯酚—硫酸法測定羅漢果多糖含量，具體操作參考韋曉潔等（2018）的方法。

1.3.2 造模與給藥?實驗小鼠隨機分成正常組、模型組，左旋咪唑組及羅漢果多糖低、中、高劑量組，除正常組外，其他組小鼠連續(xù)5 d腹腔注射新鮮配置的環(huán)磷酰胺溶液（20 mg·kg-1），建立免疫抑制小鼠模型（Manepalli et al.，2013）。造模成功后左旋咪唑組小鼠灌胃給藥左旋咪唑，劑量為20 mg·kg-1;羅漢果多糖低、中、高劑量組分別以25、50、100 mg·kg-1灌胃給藥;模型組和正常組小鼠給予等體積蒸餾水。各組小鼠給藥每天1次，連續(xù)給藥14 d。

1.3.3 小鼠免疫器官指數(shù)的測定?各實驗組隨機取10只小鼠，末次給藥24 h后，脫頸椎處死小鼠，稱量體重，無菌條件下迅速取出脾臟和胸腺器官清洗干凈并稱重，計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，脾指數(shù)=脾重量/小鼠體重;胸腺指數(shù)=胸腺重量/小鼠體重。

1.3.4 小鼠T、B淋巴細胞增殖能力的測定?將1.3.3 實驗中稱重后的無菌脾臟研磨，過200目篩，無菌條件下制備脾細胞懸液，調(diào)整細胞濃度到每毫升2×106 個。在96孔細胞培養(yǎng)板上加入每孔100 μL的脾臟淋巴細胞懸液，實驗孔和對照孔設(shè)3個重復，實驗孔加入ConA（質(zhì)量濃度為5 mg·L-1）每孔50 μL，對照孔加入每孔50 μL RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)44 h 后，加入MTT溶液每孔20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后終止反應(yīng)，以酶標儀測各孔OD570值。測定B淋巴細胞增殖能力，則是將ConA換成脂多糖溶液（濃度為10 mg·L-1），按上述操作進行測定。計算T、B淋巴細胞刺激值（stimulation index，SI），SI=實驗孔OD值/對照孔OD值。

1.3.5 小鼠碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的測定?各實驗組隨機取10只小鼠，末次給藥24 h后，每只小鼠的尾部靜脈按0.1 mL·10 g-1的量注入10%墨汁，在不同的時間里兩次眼眶取血20?μL，各加入2 mL 0.1% NaCO3溶液中，搖勻，于680 nm測定吸光度A。將小鼠脫頸椎處死，取免疫器官稱重，計算碳廓清指數(shù)（K）和吞噬指數(shù)（α）。

K=lgA1-lgA2t2-t1; α=

3K×體重肝重+脾重。

式中，t1 、t2為前后兩次注射墨汁的時間。

1.3.6 小鼠皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)的指標測定?各實驗組隨機取10只小鼠，末次給藥24 h后，腹壁按3 cm × 3 cm進行脫毛，次日用50?μL 1%的2，4-二硝基氟苯在脫毛處涂抹，過5 d后用移液槍取10?μL的2，4-二硝基氟苯勻抹右耳。涂抹24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，用6 mm的打孔器取左右兩片耳，比較重量差異。

1.3.7 小鼠血清溶血素水平及血清中IgG、IgM的測定?各實驗組隨機取10只小鼠，末次給藥24 h后，取0.2 mL 5%雞血紅細胞混懸液注入小鼠腹腔。免疫7 d后，取小鼠血清，用生理鹽水稀釋100倍，取1 mL，加入0.5 mL 5%雞紅細胞懸液、0.5 mL補體，在體外37 ℃下反應(yīng)30 min后冰水浴終止反應(yīng)，離心取上清液，于540 nm處測定OD值。另取5% 生理鹽水雞紅細胞混懸液0.20 mL ，用生理鹽水稀釋至2 mL，作為半數(shù)溶血管隨試驗管共同溫育，同法測光密度OD值，計算半數(shù)溶血值（HC50）（宮強等，2016;李厚兵等，2012）。血清中其他指標的檢測：IgG、IgM（參照1.3.8的實驗操作，其他操作嚴格按照IgG、IgM Elisa試劑盒的說明書進行）。

HC50=樣品管OD540半數(shù)溶血管OD540×稀釋倍數(shù)。

1.3.8小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α的含量測定?各實驗組隨機取10只小鼠，末次給藥24 h后，眼眶取血，離心取血清，采用ELISA法測定IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α的含量。將酶標包被板分為空白孔、標準孔和待測血清樣品孔，空白孔加標準品稀釋液50 μL，標準孔依次加不同稀釋濃度的標準品溶液50 μL，樣品孔加樣品稀釋液40 μL，再加各實驗組待測血清10 μL，避光37 ℃溫育30 min，用濃縮洗滌液洗板，重復5次，拍干。除空白孔外每孔加入酶標試劑50 μL，避光37 ℃ 溫育30 min，洗板5次后拍干，每孔先后各加入50 μL的顯色劑A和顯色劑B，輕震混勻，37 ℃避光顯色30 min后終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，于450 nm波長處測吸光度，繪制標準曲線，計算IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α的含量。

1.3.9小鼠脾組織切片觀察?小鼠取脾臟，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE 染色后，觀察脾組織的病理變化。

1.3.10統(tǒng)計學處理?實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行處理，以平均值±標準差（x±s）表示數(shù)值，采用t檢驗分析處理，P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。

2?結(jié)果與分析

2.1 羅漢果多糖的紅外光譜分析、單糖組分分析及含量測定結(jié)果

2.1.1 羅漢果多糖的紅外光譜分析結(jié)果?圖1結(jié)果表明，SGP具有多糖典型的吸收峰，3 440 cm-1為糖的O-H伸縮振動，2 940 cm-1為C-H伸縮振動，1 600 cm-1 為糖醛酸的COO-非對稱伸縮振動，1 415 cm-1的吸收峰歸屬于C=O的非對稱伸縮振動峰，1 300 ～1 000 cm-1處出現(xiàn)吸收峰是吡喃環(huán)的伸縮振動，765 cm-1的存在表明有D-木糖。

2.1.2 羅漢果多糖的單糖組分分析及含量測定結(jié)果?采用苯酚—硫酸法測定羅漢果多糖含量為98.2%。由圖2可知，羅漢果多糖樣品中峰1、峰3、峰4、峰5分離程度較好，且與標準單糖中對應(yīng)單糖的保留時間相同，提示羅漢果多糖中含有甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖和木糖，其中葡萄糖的含量較高。此結(jié)果與王海英等（2015）報道的有一定差異。

2.2 羅漢果多糖對免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是非常重要的免疫器官，對機體的免疫功能至關(guān)重要;吞噬細胞在免疫應(yīng)答中主要依靠吞噬功能發(fā)揮作用，機體可通過吞噬細胞吞噬外來細菌或病毒起到防御作用（Bing et al.，2013）。免疫器官指數(shù)客觀反映免疫抑制小鼠免疫器官功能的強弱。由表1可知，羅漢果多糖各劑量組和左旋咪唑組小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)與模型組比較有明顯提高且差異顯著（P<0.05或P<0.01），羅漢果多糖高劑量組（100 mg·kg-1）和左旋咪唑組差異極顯著（P<0.01）;羅漢果多糖中、高劑量組（50、100 mg·kg-1）和左旋咪唑組與正常組比較差異顯著（P<0.05）。結(jié)果顯示羅漢果多糖能提高免疫抑制小鼠脾臟、胸腺指數(shù)，其作用機制可能是羅漢果多糖可以修復免疫抑制小鼠脾臟、胸腺中被破壞的細胞，刺激和促進受損細胞的再生和發(fā)育。

2.3 羅漢果多糖對免疫抑制小鼠T、B淋巴細胞增殖能力的影響

由表2可知，與模型組相比較，羅漢果多糖中、高劑量組（50、100 mg·kg-1）和左旋咪唑組差異顯著（P<0.05或P<0.01），表明一定劑量的羅漢果多糖能增強免疫抑制小鼠T淋巴細胞增殖能力。表2結(jié)果顯示，與模型組相比較，羅漢果多糖各劑量組和左旋咪唑組差異顯著（P<0.05或P<0.01），說明羅漢果多糖對免疫抑制小鼠B淋巴細胞增殖能力具有促進作用。

2.4 羅漢果多糖對免疫抑制小鼠碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響

廓清指數(shù)（K）和吞噬指數(shù)（α）可反映吞噬細胞的吞噬能力。由表3可知，羅漢果多糖各劑量組和左旋咪唑組小鼠的碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)與模型組相比有所提高。羅漢果多糖中劑量組差異顯著（P<0.05），高劑量組和左旋咪唑組差異極顯著（P<0.01）;羅漢果多糖中、高劑量組（50、100 mg·kg-1）和左旋咪唑組與正常組比較差異顯著（P<0.05）。表3結(jié)果還顯示，羅漢果多糖能顯著提高廓清指數(shù)（K）和吞噬指數(shù)（α）、增加免疫抑制小鼠吞噬細胞數(shù)量、提高吞噬細胞的活力、增強吞噬功能，對免疫抑制小鼠固有免疫有一定促進作用。

2.5 羅漢果多糖對免疫抑制小鼠皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)水平的影響

遲發(fā)型超敏反應(yīng)中，T淋巴細胞介導的細胞免疫起著重要作用（Venarske et al.，2003;Dale et al.，2003）。選用2，4-二硝基氟苯誘發(fā)遲發(fā)型過敏反應(yīng)，通過測定耳部腫脹度，可以反映小鼠細胞免疫能力的強弱。如表4所示，與模型組相比，羅漢果多糖各劑量組和左旋咪唑組小鼠的耳腫脹度差異顯著（P<0.05或P<0.01），羅漢果多糖高劑量組（100 mg·kg-1）和左旋咪唑組差異極顯著（P<0.01）;羅漢果多糖高劑量組（100 mg·kg-1）和左旋咪唑組與正常組比較差異顯著（P<0.05）。這說明羅漢果多糖能明顯降低其耳腫脹度，使之恢復或接近正常水平。

2.6 羅漢果多糖對免疫抑制小鼠血清溶血素水平及血清中IgG、IgM的影響

機體受到抗原刺激后，可產(chǎn)生大量的免疫球蛋白（Ig） ，與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，增強機體免疫功能。測定血清上清液的吸光度值、HC50以及抗體IgG、IgM含量，衡量機體的體液免疫強度。由表5可知，與模型組比較，羅漢果多糖各劑量組和左旋咪唑組小鼠的溶血素OD值、HC50以及IgG、IgM含量有所提高。其中，羅漢果多糖高、中劑量組溶血素OD值、HC50值與模型組比較差異顯著（P<0.05）;羅漢果多糖低劑量組（25 mg·kg-1）小鼠的IgG、IgM含量與模型組比較差異顯著（P<0.05）;羅漢果多糖中、高劑量組（50、100 mg·kg-1）的IgG、IgM含量與模型組和正常組比較差異顯著（P<0.05或P<0.01）。這表明羅漢果多糖可以提高免疫抑制小鼠血清中抗體水平，增強機體免疫功能。

2.7 羅漢果多糖對免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6，TNF-α含量的影響

IL-2、IL-4、IL-6是細胞免疫分泌的細胞因子，可促進免疫細胞的增殖與分化，增強免疫細胞的免疫能力。TNF-α具有廣泛生物學作用，是機體免疫防護的重要介質(zhì)，可促進細胞增殖分化，增強T細胞及其他殺傷細胞的殺傷能力。由表6可知，與模型組相比，羅漢果多糖各劑量組和左旋咪唑組小鼠血清中的IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α含量均提高。羅漢果多糖各劑量組和左旋咪唑組IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α的含量與模型組比較差異顯著（P<0.05或P<0.01），羅漢果多糖中、高劑量組（50、100 mg·kg-1）和左旋咪唑組與正常組比較差異顯著（P<0.05）。實驗結(jié)果表明羅漢果多糖能促進細胞因子分泌水平。

2.8 羅漢果多糖對免疫抑制小鼠脾組織形態(tài)的影響

從圖3可以看出，正常組小鼠脾組織細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，無炎癥細胞浸潤。模型組小鼠脾細胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)破損，伴有炎癥細胞浸潤，可見壞死斑點。左旋咪唑組小鼠脾細胞排列較整齊，細胞大小較一致，結(jié)構(gòu)較完整，部分細胞腫脹并有少許胞漿疏松和炎癥細胞浸潤，說明左旋咪唑?qū)γ庖咭种菩∈笃⒓毎哂休^好的治療作用。羅漢果多糖各劑量組小鼠脾細胞排列有些紊亂，細胞腫脹、炎癥細胞浸潤及壞死情況均有不同程度的減輕。病理學觀察表明羅漢果多糖能夠有效恢復免疫抑制小鼠受損的脾細胞。

3?討論與結(jié)論

近年來，中藥多糖成分調(diào)節(jié)免疫功能方面的研究取得了較大進展（Sun et al.，2015;Gong et al.，2015），中醫(yī)藥治療疾病側(cè)重在于發(fā)揮與調(diào)動機體的抗病能力，調(diào)整機體的免疫功能狀態(tài)。尚慶輝等（2015）發(fā)現(xiàn)中藥多糖可通過修復免疫器官受損的免疫細胞;促進淋巴細胞分泌細胞因子并提高細胞因子的活性;增強巨噬細胞吞噬活性; 提升自然殺傷細胞的殺傷水平;加快免疫細胞增殖分化水平等，使得機體的免疫功能增強。

胸腺和脾臟是動物機體重要的免疫器官， T、B淋巴細胞在此增殖分化，故胸腺和脾臟是機體免疫功能調(diào)節(jié)的重要場所。病理學觀察表明羅漢果多糖能夠有效恢復免疫抑制小鼠受損的脾細胞。本研究結(jié)果表明，羅漢果多糖能夠顯著提高免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)，其作用機制可能是羅漢果多糖可以修復免疫抑制小鼠免疫器官中被破壞的細胞，刺激和促進萎縮的脾臟和胸腺的再生和發(fā)育。同時，羅漢果多糖能夠增強免疫抑制小鼠T、B淋巴細胞的增殖轉(zhuǎn)化能力，提高細胞免疫功能。

碳廓清實驗結(jié)果顯示，中、高劑量的羅漢果多糖能顯著提高廓清指數(shù)（K）和吞噬指數(shù)（α），提高免疫抑制小鼠固有免疫水平，作用機制可能是增加機體吞噬細胞數(shù)量，提高吞噬細胞的活力，增強吞噬功能，有效吞噬外來抗原，并提高NK細胞殺傷力，起到增強固有免疫功能的作用。

IgG 、IgM及細胞因子含量的檢測有助于從分子水平闡明體液免疫調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明，羅漢果多糖能提高血清溶血素水平，顯著增加IgG、IgM含量，有利于機體清除有害抗原，抑制炎癥反應(yīng)，并激活補體系統(tǒng);此外羅漢果多糖能促進免疫抑制小鼠淋巴細胞分泌IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α等細胞因子，提高細胞因子的活性，可促進免疫細胞的增殖和分化，還能增強免疫細胞及其他殺傷細胞的殺傷能力，故能增強免疫抑制小鼠體液免疫功能。

本研究結(jié)果表明，羅漢果多糖能拮抗環(huán)磷酰胺所致的免疫抑制作用，對免疫抑制小鼠的固有免疫、細胞免疫、體液免疫能力具有較好的促進作用，恢復機體的抗病能力，顯著增強免疫抑制小鼠的免疫功能，為羅漢果多糖作為免疫增強劑的開發(fā)應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

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