李霞 胡楠 趙啟迪 黃健玲 李培駿 周玉恒

摘?要：該研究采用氫氧化鈉-氯乙酸的化學(xué)反應(yīng)體系制備羧甲基化腸滸苔多糖，以獲得不同取代度的羧甲基化腸滸苔多糖，取代度的大小受氫氧化鈉濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的影響。結(jié)果表明：（1）當(dāng)氫氧化鈉濃度20%、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時間3 h時，得到羧甲基化的最大取代度為0.781。（2）通過體外抗氧化來評價不同羧甲基化腸滸苔多糖的抗氧化活性。（3）當(dāng)羧甲基化腸滸苔多糖的濃度為1.6 mg·mL-1時，羧甲基化腸滸苔多糖清除羥基自由基、超氧陰離子自由基的能力分別為44.45%、51.98%，其清除DPPH自由基清除率和還原能力分別為16.75%、0.457 6。（4）與修飾前的相比，羥基自由基、超氧陰離子的清除能力均有較大幅度提高，羧甲基化修飾對腸滸苔多糖的DPPH自由基和還原力有減弱作用。以上結(jié)果表明，羧甲基化修飾引起的腸滸苔多糖的結(jié)構(gòu)變化可以提高其抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：腸滸苔， 多糖， 羧甲基化修飾， 取代度， 抗氧化活性

中圖分類號：Q946.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）11-1519-08

Abstract：Enteromorpha intestinalis polysaccharides carboxymethylation（EIPC） were made in the NaOH-chloroacetic acid chemical reaction system to obtain carboxymethylated gut polysaccharides with different degrees of substitution. The degree of substitution was affected by the sodium hydroxide concentration， the reaction temperature and the reaction time. The results were as follows：（1） When the sodium hydroxide concentration was 20%， the reaction temperature was 60 ℃， and the reaction time was 3 h， the maximum degree of substitution for carboxymethylation was 0.781.（2） The antioxidant activities of different?polysaccharide carboxymethylations of Enteromorpha intesinalis were evaluated by in vitro antioxidant.（3） At the concentration of EPIC wsa 1.6 mg·mL-1， the scavenging activity to hydroxyl free radical and superoxide anion free radical were 44.45% and 51.98%， the ability of scavenging DPPH free radical and reducing ability were 16.75% and 0.457 6.（4） Compared with the pre-modification， the scavenging abilities of hydroxyl radicals and superoxide anion were greatly improved， and the carboxymethylation modification had a weakening effect on DPPH free radicals and reducing power of polysaccharides. The above results indicate that the structural changes of the polysaccharides caused by carboxymethylation can increase its antioxidant activity.

Key words：Enteromorpha intestinalis， polysaccharide， carboxymethyl modification， substituting degrees， antioxidant activity

滸苔是一種大型綠藻，具有較大經(jīng)濟(jì)價值，民間稱苔條、海苔，為綠藻門石莼目石莼科植物。滸苔屬在全世界范圍內(nèi)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的約有40種，我國約有11種，我國的品種主要有小管滸苔、腸滸苔、條滸苔、扁滸苔等四種，都是生長在潮濕地帶（孫士紅，2007）。滸苔藻體晾干或風(fēng)干后既可以作為中草藥使用，又可以做成食品或者加工成飼料。滸苔中營養(yǎng)成分種類多，含量豐富，含有人體必需的維生素、氨基酸、多種礦物質(zhì)和脂肪酸（吳闖等，2013）。滸苔多糖具有多種生物學(xué)活性，現(xiàn)有的文獻(xiàn)報道了其活性作用主要體現(xiàn)在抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂和抗腫瘤等方面（Kim et al.，2011;石學(xué)連等，2009;Jiao et al.，2009;林文庭和張智芳，2009;陳芳容等，2012;Li et al.，2013;Jiao et al.，2010）。

對多糖進(jìn)行合理的化學(xué)修飾可以改變多糖的生物活性（Wang et al.，2013）。目前，對多糖化學(xué)修飾或分子修飾的常見方法分為化學(xué)法、物理法和生物法，其中在生產(chǎn)中使用較多的一種處理方法是羧甲基化（申林卉等，2013;付滿等，2019）。研究表明，多糖經(jīng)過羧甲基化修飾處理后，可以顯著提高其水溶性，且其生物活性得到顯著增強(qiáng)或者被賦予新的生物活性（陳勝軍等，2019）。Parvathy et al.（2005）報道了羧甲基化半乳-甘露聚糖的溶解度顯著提高。王雁等（2000）通過修飾得到羧甲基化虎奶多糖，虎奶多糖幾乎不溶于水，修飾后的溶解性最高可達(dá)30 mg·mL-1，大大增加了機(jī)體對其的吸收率，且修飾后的多糖對Fe2+-VC引起的大鼠肝臟線粒體脂質(zhì)過氧化顯著抑制，對膜流動性的降低有良好的抑制效果，同時還能抑制線粒體的腫脹。

本研究對腸滸苔多糖進(jìn)行羧甲基化修飾，以獲得不同取代度的腸滸苔多糖，同時探索結(jié)構(gòu)修飾對腸滸苔多糖體外抗氧化活性的影響，并探究其變化規(guī)律，為開發(fā)滸苔多糖的生物功效奠定理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑?腸滸苔（Enteromorpha intesinalis），采于中國浙江杭州灣，由寧波大學(xué)朱文榮教授鑒定。氫氧化鈉、異丙醇、氯乙酸、濃鹽酸、濃硫酸、鄰苯三酚、三氯乙酸、三氯化鐵、雙氧水、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫代巴比妥酸、抗壞血酸、乙二胺四乙酸二胺等試劑均為國產(chǎn)分析純;DPPH，東京化成工業(yè)株式會社。

1.1.2 儀器與設(shè)備?控溫磁力攪拌器，上海志成電器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市子華儀器有限公司;酸度計，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）;DL-5-8型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;UV760CRT紫外可見分光光度計，上海傲譜分析儀器有限公司;傅立葉紅外光譜儀，美國Thermo Fisher公司;冷凍真空干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 腸滸苔多糖提取?腸滸苔洗凈，于50 ℃下烘干，粉碎過20目篩，80%的乙醇85 ℃冷凝回流提取3次，每次2 h，分離殘渣并干燥。稱取上述殘渣5 g，按照一定料液比加入蒸餾水，水浴提取，抽濾，濾液離心得上清液濃縮，加入4倍體積無水乙醇沉淀，4 ℃靜置48 h，4 000 r·min-1，離心15 min，取沉淀干燥，得到腸滸苔粗多糖（Enteromorpha intesinalis polysaccharide， EIP）（劉玉鳳等，2016）。

1.2.2 羧甲基化腸滸苔多糖?腸滸苔粗多糖羧甲基化采用氫氧化鈉-氯乙酸化學(xué)法進(jìn)行制備（Silva et al.，2004）。稱量120 mg腸滸苔多糖，加入10 mL 20% NaOH和25 mL的異丙醇溶液，冰浴、攪拌3 h后制成均勻懸濁液。將混合液（25 mL異丙醇溶有3 g氯乙酸和10 mL 20% NaOH制備的混合液）緩慢滴入反應(yīng)體系中，逐漸升溫至60 ℃，攪拌3 h，停止反應(yīng)，冷卻至室溫。用1 mol·L-1的鹽酸調(diào)pH=7。用流水和蒸餾水分別透析48 h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶液，冷凍干燥，得到羧甲基化腸滸苔多糖（Enteromorpha intesinalis polysaccharide carboxymethylation， EIPC）。

1.2.3 紅外光譜分析?分別稱取2 mg的EIP和EIPC加入100 mg干燥KBr于瑪瑙研缽中，研磨均勻，壓片。進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.2.4 EIP羧甲基單因素試驗?NaOH濃度：稱取EIP 120 mg，在氯乙酸用量3 g、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時間3 h條件下，考察不同NaOH濃度（10%、15%、20%、25%、30%）對滸苔多糖羧甲基化取代度的影響。

反應(yīng)溫度：稱取EIP 120 mg，在氯乙酸用量3 g、20% NaOH濃度、反應(yīng)時間3 h條件下，考察不同溫度（40、50、60、70、80 ℃）對滸苔多糖羧甲基化取代度的影響。

反應(yīng)時間：稱取EIP 120 mg，在氯乙酸用量3 g、反應(yīng)溫度60 ℃、20% NaOH濃度條件下，考察不同反應(yīng)時間（1、2、3、4、5 h）對滸苔多糖羧甲基化取代度的影響。

1.2.5 EIPC羧甲基化取代度測定?于試管中先分別加入0.25 mL 0.5 mg·mL-1的EIPC溶液和0.25 mL濃硫酸，混勻，125 ℃加熱3 h后取出，再加入2 mL 2，7-二羥基萘溶液，混勻后于沸水浴中加熱20 min，冷卻至室溫，最后加入2 mL的蒸餾水，以樣品空白為對照，測定其520 nm吸收值（Eyler et al.，1947）。同時，用羥基乙酸替代多糖樣品計算每克多糖樣品中羥基乙酸的克數(shù)，記為A，按以下公式，計算EIPC取代度的值：

DS=162A/（76-80A）。

式中，DS為取代度，A為每1 g樣品中羥基乙酸的克數(shù)。

1.2.6 EIPC抗氧化活性測定?通過測定EIPC對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除能力和還原能力（劉玉鳳等，2016）來判斷EIPC的抗氧化活性。將不同取代度的樣品配制成0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg·mL-1等6種不同濃度樣品，比較不同取代度羧甲基化腸滸苔多糖的抗氧化活性。

（1）DPPH自由基清除能力測定：量取配制的待測樣品液2.0 mL，加入2.0 mL 0.04 mg·mL-1 DPPH溶液（無水乙醇作為溶劑），充分混勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測定其吸光度Ai，同時測定無水乙醇（2.0 mL）與DPPH（2.0 mL）混合液的吸光度Ac，無水乙醇（2.0 mL）和樣品液（2.0 mL）混合液的吸光度Aj。DPPH自由基清除率計算公式：K=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%。

（2）超氧陰離子清除能力測定：精確量取4.5 mL Tris-HCl溶液（50 mmol·L-1，pH=8.2）于試管，在25 ℃溫水中預(yù)熱20 min，之后依次加入同樣預(yù)熱條件下預(yù)熱的鄰苯三酚溶液（25 mmo1·L-1）0.3 mL和樣品0.2 mL，并迅速混勻倒入比色皿，波長319 nm處測定吸光度At，每30 s測一次，測定8次。以去離子水作為空白對照，同樣操作條件下測定并計算鄰苯三酚自氧化速率V0。以At為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)作圖，計算斜率Vt。超氧陰離子自由基清除率計算公式：K=（1-Vt/V0）×100%。

（3）羥基自由基的清除能力測定：取0.2 mL的FeSO4-EDTA混合液（10 mmol·L-1）于帶塞試管中，加入0.2 mL的α-脫氧核糖溶液（20 mmol·L-1），然后再加入0.2 mL樣品，并用磷酸緩沖液（0.2 mol·L-1， pH=7.4）定容至1.8 mL，然后加入0.2 mL的H2O2（10 mmol·L-1），40 ℃恒溫水浴1 h，加入1 mL 2.8%的三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入1 mL 1%硫代巴比妥酸，混勻之后于沸水浴中加熱10 min，冷卻后于532 nm處測光吸收值A(chǔ)S。以去離子水為陰性對照，測定吸光值A(chǔ)0，抗壞血酸為陽性對照，測定吸光值A(chǔ)C。樣品的自由基清除能力計算公式：

K=[1-（AS–A0）/（AC–A0）]×100%。

（4）還原能力測定：移取0.5 mL羧甲基化多糖溶液與試管中，并加入0.5 mL 0.2 mol·L-1 PBS緩沖液（pH=6.7）和0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴鍋恒溫20 min后冷卻，加入0.5 mL 10%三氯乙酸溶液，依次加入2 mL蒸餾水，0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液充分混勻，靜置10 min后，在紫外-可見分光光度計700 nm波長處測定溶液吸光值。

2?結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜分析

將EIP和EIPC樣品置于傅里葉紅外光譜分析儀Nicolet iS 10中進(jìn)行光譜表征，其測定紅外光譜波長范圍為4 000～400 cm-1，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，腸滸苔多糖的羧甲基化修飾產(chǎn)物，不僅具有多糖的特征紅外吸收峰，即3 441 cm-1（O-H）、1 260 cm-1、1 204 cm-1、1 077 cm-1（C-O-H），而且在1 611 cm-1羧基（-COOH）的C=O非對稱振動吸收峰、1 422 cm-1處與羧基相連的甲基（-CH3）的C-H變角振動吸收、1 328 cm-1處C=O的對稱伸縮吸收增強(qiáng)明顯，表明了羧甲基化腸滸苔多糖中羧甲基（-CH2-COOH）的存在。

2.2 單因素試驗

設(shè)置NaOH濃度10%、15%～30%，反應(yīng)溫度40 ℃、50～80 ℃，反應(yīng)時間1 h、2～5 h，研究不同因素對腸滸苔多糖羧甲基化取代度的影響，其結(jié)果見圖2。

由圖2可知，EIPC的取代度隨NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時， 取代度達(dá)到最大，為0.701。隨著NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，NaOH的總量增加，分子滲透到多糖分子的機(jī)率增加，使得腸滸苔多糖溶脹更充分，活性中心也隨之增加，其與氯乙酸接觸反應(yīng)的機(jī)會增多，相應(yīng)醚化反應(yīng)效率更高，從而使反應(yīng)的取代度增加。但是，如果溶液中存在過量的NaOH，會導(dǎo)致氯乙酸發(fā)生副反應(yīng)，使得氯乙酸利用率降低，反而會降低取代度。因此，選擇氫氧化鈉-氯乙酸化學(xué)法修飾腸滸苔多糖的NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。

EIPC的取代度隨反應(yīng)溫度升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。溫度逐漸升高，分子運(yùn)動速度加快，分子間相互碰撞機(jī)會增加，使多糖的取代度不斷增加。當(dāng)反應(yīng)溫度到60 ℃時，EIPC的取代度最大，為0.701。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，造成氯乙酸水解副產(chǎn)物增多和多糖在堿性介質(zhì)中發(fā)生降解而使EIPC取代度降低。因此，選擇氫氧化鈉-氯乙酸化學(xué)法修飾腸滸苔多糖的反應(yīng)溫度為60 ℃。

隨著加熱反應(yīng)時間的增加，EIPC取代度增加。加熱時間1～3 h，隨著加熱時間增加，反應(yīng)活性中心增多，醚化反應(yīng)速率加快，因此EIPC的取代度顯著增加。當(dāng)加熱時間超過3 h后，既會造成反應(yīng)速率加快，又會使其副產(chǎn)物增多或不穩(wěn)定中間產(chǎn)物分解，造成其取代度幾乎不再增加。過長的加熱時間不僅費時，而且還會造成能源浪費。因此，綜合考慮選擇氫氧化鈉-氯乙酸化學(xué)法修飾腸滸苔多糖的反應(yīng)時間為3 h，此時取代度為0.702。

2.3 腸滸苔多糖羧甲基化修飾對抗氧化活性的影響

2.3.1 DPPH自由基清除能力?隨著取代度的不斷增大，EIPC對DPPH自由基的清除作用呈現(xiàn)下降趨勢。總體來看取代度和清除率之間呈現(xiàn)比較明顯的線性規(guī)律，說明羧甲基化修飾的取代度越大，腸滸苔多糖對DPPH自由基的清除能力越弱，表明羧甲基化修飾不利于腸滸苔多糖清除DPPH自由基（圖3）。

EIP和EIPC對DPPH自由基的清除作用均是隨著多糖濃度的增大而增大，當(dāng)多糖濃度為0.8 mg·mL-1時，對DPPH自由基的清除效果最好，其值分別為20.14%、39.24%，當(dāng)大于0.8 mg·mL-1時，EIP和EIPC對DPPH自由基的清除能力有所下降。在同一濃度下，EIP的清除率是EIPC的2倍（圖4）。

2.3.2 還原性能力?多糖的還原能力與其吸光度值呈正相關(guān)，吸光度值越大表明其還原能力越強(qiáng)。故通過比較吸光度值的大小可以用來評價多糖的抗氧化性強(qiáng)弱。隨著取代度的不斷增大，羧甲基化腸滸苔多糖的還原性作用呈現(xiàn)下降的趨勢，即羧甲基化修飾的取代度越大，腸滸苔多糖的還原性能力越弱，表明羧甲基化修飾不利于腸滸苔多糖還原性的發(fā)揮（圖3）。

在一定的濃度范圍內(nèi)，EIP和EIPC的還原能力與濃度呈正相關(guān)，當(dāng)多糖濃度為0.8 mg·mL-1時，吸光度值分別為1.26、0.59，當(dāng)濃度大于0.8 mg·mL-1時，其清除能力均略有下降。與Vc相比，EIP和EIPC的還原能力都比較低，且EIPC的還原能力最低（圖4）。

2.3.3 羥基自由基清除能力?隨著取代度的不斷增大，羧甲基化腸滸苔多糖對羥基自由基的清除作用呈現(xiàn)上升趨勢。在一定的取代度范圍內(nèi)，EIPC對羥基自由基的清除率呈持續(xù)上升的趨勢，總體上，羧甲基化修飾的取代度越大，腸滸苔多糖的清除羥基自由基的能力越弱，表明羧甲基化修飾有利于腸滸苔多糖清除羥基自由基（圖3）。

EIP和EIPC的羥基自由基清除能力均是隨著濃度的增大而緩慢增大。當(dāng)濃度為1.6?mg·mL-1時，羥基自由基的清除能力趨于平緩，其值分別為19.84%、44.45%。同一濃度下，羧甲基化修飾后的腸滸苔多糖清除率是未羧甲基化的將近2倍。與Vc的羥基自由基清除能力對比，修飾后的清除能力顯著增加，說明腸滸苔多糖的羧甲基化修飾有利于其對羥基自由基的清除能力（圖4）。

2.3.4 超氧陰離子清除能力?EIPC對超氧陰離子自由基的清除能力，總體上是隨著取代度的增大而增大，與其對羥基自由基的清除率類似（圖3）。

EIP和EIPC對超氧陰離子的清除作用均是隨著濃度的增大而增大，當(dāng)濃度為1.6 mg·mL-1時，其超氧陰離子的清除能力分別為28.94%、51.98%。同一濃度下，羧甲基化修飾的腸滸苔多糖清除率與未修飾的相比，其超氧陰離子的清除能力有很大的提升，說明羧甲基化修飾對腸滸苔多糖清除超氧陰離子能力有顯著的增強(qiáng)作用。說明腸滸苔多糖的羧甲基化修飾有利于其對超氧陰離子的清除作用（圖4）。

3?結(jié)論

通過氫氧化鈉-氯乙酸法對腸滸苔多糖進(jìn)行羧甲基化修飾，羧甲基化程度受氫氧化鈉濃度、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間的影響。當(dāng)120 mg腸滸苔多糖、20%的異丙醇-氫氧化鈉濃、3.0 g氯乙酸、反應(yīng)溫度為60 ℃、反應(yīng)時間為3 h時，EIPC的取代度最大，為0.781。在該實驗中，腸滸苔多糖對清除羥自由基以及清除超氧陰離子自由基能力的增幅比較大，當(dāng)濃度為1.6 mg·mL-1時，對羥基自由基的清除效果由原來的22.45%增加到了44.46%，清除超氧陰離子自由基的能力由28.94%增加到了51.98%。而其清除DPPH自由基的能力和還原性能力均隨著腸滸苔多糖濃度的增大而增大，但是修飾后的腸滸苔多糖清除DPPH自由基的能力和還原性能力均降低。可能是由于在化學(xué)修飾后，活性部位被修飾，而導(dǎo)致抗氧化活性的差異。隨著取代度的增大，對清除羥自由基以及清除超氧陰離子自由基的能力而呈非線性增大，對清除DPPH自由基的能力和還原性能力而減小，羧甲基化修飾可以改變腸滸苔多糖的抗氧化活性，但是羧甲基化修飾的取代度并不是影響其抗氧化活性的唯一因素。因此，化學(xué)修飾是改變腸滸苔多糖活性的一種重要手段，無論是在生產(chǎn)應(yīng)用上，還是在活性部位識別的研究上，都有重要的意義。

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