楊 陽　郎文凱　楊 茂　劉文英

[摘要]隨著時代發(fā)展與社會進步，細菌從被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在已經(jīng)與人們的生活息息相關(guān)，怎樣抑制一些細菌的生長成為人們關(guān)注的問題。本實驗以沙棘葉為原料，通過乙醇提取，再經(jīng)過多級萃取，然后使用平板涂布菌種的方法探究沙棘葉正丁醇萃取物對三種細菌的抑菌效果。結(jié)果表明，沙棘葉正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌三種細菌的確具有抑制效果。

[關(guān)鍵詞]沙棘葉;正丁醇;抑菌活性

中圖分類號：Q946.91 文獻標識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.201912

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）又名醋柳、酸刺，胡頹子科沙棘屬，是西藏本地醫(yī)生、蒙古本地醫(yī)生習用藥材。沙棘可以在許多惡劣的條件下生存，是防風暴、固定沙土、防止水土流失、保護生態(tài)環(huán)境價值最高的樹種[1]。

有研究表明，沙棘葉黃銅提取物對人體的皮下組織具有抗炎作用[2]，對于促進傷口的愈合，治療炎癥與燙傷等有很好的效果[3]。沙棘果實營養(yǎng)豐富，據(jù)測定，其果實中含有多種維生素、脂肪酸、微量元素、亞油素、沙棘黃酮等活性物質(zhì)和人體所需的各種氨基酸[4]。近年研究還表明沙棘黃酮具有抗氧化、抗?jié)?、抗腫瘤、抗心律失常、增強機體免疫力、提高耐缺氧能力等藥理功效[5-6]，且沙棘果多糖具有明顯的抗氧化活性，抗氧化作用隨濃度增加而加大[7]。

本文開展了沙棘葉抑制細菌生長的實驗研究，對進一步了解沙棘葉的抑菌機理以及今后開發(fā)利用沙棘以及沙棘葉等沙棘相關(guān)產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

1 試驗概述

1.1 主要儀器和設備

恒溫培養(yǎng)箱：北京恒奧德科技有限公司;電子秤：廈門雄發(fā)儀器儀表有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋：山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司;超凈工作臺：南京貝登電子商務有限公司;恒溫水浴鍋：蘇州江東精密儀器有限公司;分液漏斗、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海科興儀器有限公司;電磁爐：美的集團有限公司。

1.2 菌種

大同大學生命科學學院提供的菌種為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus arueus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subfilis）。

1.3 主要藥品

95% 乙醇、瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，瓊脂15～25g，加水1 000mL，調(diào)pH到7.4～7.6。

1.4.2 液體培養(yǎng)基

牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，氯化鈉0.5g，蒸餾水100mL，調(diào)pH到7.2～7.5。

1.5 沙棘材料

沙棘采用的是中國沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.），沙棘葉購買于山西五臺山沙棘制品有限公司，為確保數(shù)量可以完成實驗，購買500g。

1.6 沙棘葉正丁醇萃取物的制備

沙棘葉正丁醇萃取流程圖，見圖1。

1.6.1 沙棘葉粉碎

沙棘葉放入粉碎機中粉碎后取出篩選，將體積大的葉片加入粉碎機進行二次粉碎，將兩次結(jié)果合并，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 沙棘葉粉末乙醇浸提

取100g沙棘葉粉末分別加入1L燒杯中，共4個燒杯，再分別加入1L 95%乙醇，拿玻璃棒輕微攪拌后放入4℃冰箱5h，取出后經(jīng)過濾得到濾液，保存?zhèn)溆?。再取濾渣分別放入4個1L燒杯中，重復上述步驟，棄去濾渣，將所有濾液合并。

1.6.3 減壓濃縮

啟動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的冷凝裝置，打開水浴鍋，調(diào)節(jié)溫度為45℃，安裝回收溶劑瓶，然后打開真空泵里邊的循環(huán)水，再打開開關(guān)，將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的放氣活塞關(guān)閉并將沙棘葉乙醇提取液加入旋轉(zhuǎn)瓶。當整個系統(tǒng)達到一定的真空度時，打開旋轉(zhuǎn)按鈕并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速。等旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)結(jié)束后，得到浸膏，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.4 石油醚萃取

將上一步得到的浸膏放入燒杯中，加入部分蒸餾水攪拌使其完全溶解。再加入3倍上步蒸餾水體積的石油醚，一起加入已經(jīng)經(jīng)過檢漏的分液漏斗中，將其搖晃充分后，將分液漏斗固定并等待其中的液體靜止分層，之后將水層和石油醚萃取液分離。按照上述過程操作3次，合并本步驟所有的萃取液，將其室溫條件密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.5 乙酸乙酯萃取

將上一步得到的蒸餾水溶液再加入分液漏斗中，用3倍體積乙酸乙酯來與其混合，然后用上一步的萃取操作重復3次萃取，之后合并所有乙酸乙酯的萃取液。

1.6.6 正丁醇萃取

將上一步蒸餾水溶液加入分液漏斗，同樣加入3倍正丁醇和蒸餾水層充分混合，再用上一步萃取的操作重復3次萃取，最后合并所有的萃取液，將其保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.7 減壓濃縮

將石油醚萃取液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，通過操作成為浸膏。然后將乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液用同樣的操作達到浸膏，再放入冰箱冷凍干燥，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 抑菌實驗

1.7.1 菌株活化

在超凈工作臺內(nèi)用無菌接種環(huán)將試驗菌種接到做好標簽標記的斜面培養(yǎng)基上，然后把細菌置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度設置為36℃，時間為22h，最后放入0℃～4℃冰箱冷藏，準備接下來步驟使用。

1.7.2 培養(yǎng)基平板的配制

將配置好的培養(yǎng)基倒入錐形瓶中，使用高壓蒸汽滅菌鍋濕熱滅菌后取出，放進超凈工作臺。放好之后等待培養(yǎng)基凝固，為防止污染，需將平板倒置。最后將所有平板擺放整齊，在無菌條件下保存。

1.7.3 菌懸液的配制

在無菌的操作條件下，取出活化培養(yǎng)好的菌，用接種環(huán)分別挑取三種菌，分別接入經(jīng)過高壓蒸汽滅菌的無菌水中，輕微震蕩使其均勻。然后用麥氏比濁法測菌懸液濃度，通過加入無菌水等方法控制菌懸液中的細菌數(shù)為1×108～2×108個/mL。

1.7.4 沙棘葉正丁醇提取液的配制

將沙棘葉正丁醇萃取物用電子秤稱量0.5g、1.0g、1.5g、2.0g，將其分別放入小試管后再分別加入1mL正丁醇，攪拌搖晃使其溶解。

1.7.5 用濾紙片法測定沙棘葉正丁醇萃取物的抑菌效果

首先在濾紙上畫好半徑3mm的圈，再用剪刀把濾紙剪成直徑為6mm的小圓片，分別放置于小試管內(nèi)，用報紙包裹，并將其扎緊。準備好后，進行滅菌。將滅菌后的濾紙片放在超凈工作臺中，分別放入之前準備好的無菌水與提取液中，浸泡放置，以備后用。然后使用移液槍分別取300μL三種菌懸液。用無菌涂布器均勻涂布，用無菌的鑷子，分別鑷取不同濃度濾紙片，輕輕地貼在前幾步制好的平板。同時把對照組的紙片也貼在平板上。每個含菌平板上間隔一定距離貼5片，具體紙片間距大于20mm，紙片與培養(yǎng)皿壁間距超過12mm。通過培養(yǎng)后測抑菌圈直徑。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有的實驗均重復3次，之后利用Excel 2003進行標準曲線的繪制與數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 沙棘葉正丁醇萃取結(jié)果

沙棘葉萃取結(jié)果，見圖2。

2.2 沙棘葉正丁醇萃取物的抑菌作用

2.2.1 沙棘葉正丁醇萃取物對大腸桿菌的抑制效果

通過觀察培養(yǎng)基，可以看出陰性對照組的抑菌圈幾乎沒有，而其余經(jīng)過沙棘葉正丁醇萃取物浸泡后的紙片，均出現(xiàn)了抑菌圈，其中萃取液濃度為0.5g/mL和1.0g/mL的紙片抑菌圈小一點，2g/mL的紙片抑菌效果最好（見表1），抑菌圈周圍出現(xiàn)不同程度向周圍擴散的無菌區(qū)域，由此可知，沙棘葉正丁醇萃取物可以抑制大腸桿菌的生長且抑菌效果較為明顯。

2.2.2 沙棘葉正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果

觀察培養(yǎng)基，可以看到經(jīng)過沙棘葉正丁醇萃取物浸泡后的紙片均出現(xiàn)了抑菌圈，其中萃取液濃度為1.0g/mL的紙片抑菌圈小一點，達到了9mm，萃取液濃度是2g/mL的紙片抑菌效果較好，達到了11mm（見表2）。

其中抑菌圈周圍出現(xiàn)不同程度向周圍擴散的無菌區(qū)域，而相對于沒有萃取物浸泡的紙片，并不存在抑制效果。因此，沙棘葉正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌的生長確實存在抑制效果。并且由于抑菌圈較大，因此可以認為效果較好。

2.2.3 沙棘葉正丁醇萃取物對枯草芽孢桿菌的抑制效果

觀察培養(yǎng)基，可以看出陰性對照組抑菌圈沒有，而其余幾組經(jīng)過沙棘葉正丁醇萃取物浸泡后的紙片，在培養(yǎng)基上均出現(xiàn)了抑菌圈，其中萃取液濃度為0.5g/mL的抑菌圈為8mm，萃取液濃度為1.0g/mL的紙片抑菌圈為9mm，萃取液濃度為2g/mL的紙片抑菌效果最好，達到了12mm（見表3），其中抑菌圈周圍出現(xiàn)不同程度的向周圍擴散的無菌區(qū)域，沙棘葉正丁醇萃取物對大腸桿菌的生長確實存在抑制效果，并且由于萃取物成分復雜，且一定范圍內(nèi)，抑菌效果隨萃取物的濃度變化而變化，因此濃度越高抑菌效果就越好。

2.3 抑菌實驗結(jié)果及分析

根據(jù)實驗結(jié)果可知，沙棘葉正丁醇萃取物對三種試驗菌都存在不同程度的抑制作用，并且抑制效果非常明顯。在一定范圍內(nèi)，抑菌效果隨萃取物的濃度而變化，濃度越高抑菌效果就越好。

本文對沙棘葉進行較為常規(guī)的提取萃取，從中提取部分有效成分，并對其抑菌活性做了研究。本次研究的初步成果可以作為食品保鮮防腐的技術(shù)參考，沙棘葉正丁醇萃取物可以有效抑制有害菌的生長，也有利于沙棘葉資源的綜合利用。

關(guān)于萃取物抑菌效果，劉世旺等[8]將不同濃度虎耳草乙醇提取物對三種實驗菌進行抑菌實驗。其實驗結(jié)果與本實驗對照比較來看，沙棘葉正丁醇萃取物與虎耳草乙醇提取物對三種菌的抑菌效果相差無幾，并且沙棘葉正丁醇萃取物對枯草芽孢桿菌的抑菌效果較虎耳草乙醇提取物強。

在萃取物應用方面，因為食品中常常含有本次實驗的三種試驗菌，其均為對人體有害菌，很有可能會引起食物中毒，甚至可能會導致死亡。故而，沙棘葉正丁醇萃取物可以當作一種很好的食品保鮮防腐劑。

就沙棘葉今后的發(fā)展來說，因為沙棘葉中含有的多種活性成分，除了有抑菌作用，還有許多藥理作用。沙棘葉黃酮能有效地清除超氧陰離子和羥自由基，并且隨著黃酮提取液濃度的增大，清除率逐漸上升。不僅如此，沙棘葉還有許多的活性物質(zhì)并擁有不同的藥用價值。所以，沙棘葉中含有的活性成分是今后研究的內(nèi)容與方向。

實驗還存在不足之處，沙棘葉正丁醇萃取物的抑菌作用原理復雜，本文只是初探抑菌效果，為了保證充分地利用沙棘葉資源，對其抑菌的特點以及機理還需要進一步深入研究。

3 結(jié) 論

本實驗以沙棘葉為原料，采用乙醇浸提，然后進行多級萃取，得到沙棘葉正丁醇萃取液11.1g，分別以革蘭氏陽性菌中兩個較為常見的菌：金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，以及革蘭氏陰性菌中較為常見的大腸桿菌為試驗菌種，通過抑菌圈來評價沙棘葉正丁醇萃取物的抑菌效果。結(jié)果表明，萃取液對三種菌均出現(xiàn)不同程度的抑菌效果。沙棘葉正丁醇萃取物對革蘭氏陽性菌抑制明顯且對枯草芽孢桿菌的抑菌活性最好，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌相對來說較差，說明沙棘葉的正丁醇萃取物對革蘭氏陽性菌抑制十分明顯。經(jīng)過學者研究，原因很有可能是沙棘葉中有效的抗菌活性物質(zhì)含量比較高。并且沙棘葉正丁醇萃取物對大腸桿菌也出現(xiàn)了十分明顯的抑菌圈，由此可見，正丁醇萃取物對（下轉(zhuǎn)第頁）（上接第頁）三種試驗菌均有抑制效果。

參考文獻

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[7] 劉春蘭，楊萬政，劉海青，等.沙棘葉水溶性多糖的初步純化及體外清除自由基活性研究[J].內(nèi)蒙古大學學報（自然科學版）， 2007（1）：35-38.

[8] 劉世旺，徐艷霞.虎耳草乙醇提取物抑菌作用的研究[J].資源開發(fā)與市場，2007（6）：481-482+489.

收稿日期：2019-10-23

作者簡介：楊陽，男，博士，講師，研究方向為天然產(chǎn)物營養(yǎng)與抗菌。