蘇江　何金祥　冼康華　付傳明　黃惠錦　黃寧珍

摘要：? 該文選用牛角瓜莖段為外植體，通過(guò)組織培養(yǎng)方法探索牛角瓜組織培養(yǎng)和種苗快繁技術(shù)。結(jié)果表明：最佳外植體表面消毒方法是以0.1% HgCl2處理7 min，外植體存活率為32.3%;初代培養(yǎng)基為MS+ 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂3.5 g·L-1，培養(yǎng)20 d后形成3～4 cm高的再生芽。增殖培養(yǎng)前期篩選的較為適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂3.5 g·L-1，增殖系數(shù)4.6。但在后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，牛角瓜組培苗易玻璃化，且隨著世代更迭，玻璃化程度加重，到了第四代幾乎全部玻璃化。因此在上述增殖培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，以AgNO3作為玻璃化抑制劑，篩選出最終的增殖培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+ AgNO3 1.0 g·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂3.5 g·L-1。用此增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)25 d，苗高5～8 cm，增殖系數(shù)5.8，玻璃化率低于10%，且連續(xù)培養(yǎng)多代，玻璃化率維持在10%以下。生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+ NAA 1.0 mg·L-1+ 蔗糖20 g·L-1+ 瓊脂3.6 g·L-1，培養(yǎng)14 d，生根率98%;將生根苗移栽于70%遮陰度的大棚中，30 d后，苗高20 cm左右，成活率85%。利用該方法可對(duì)牛角瓜優(yōu)良種苗進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。

關(guān)鍵詞： 牛角瓜， 組織培養(yǎng)， 培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)：? Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A文章編號(hào)：? 1000-3142（2019）12-1648-08

Abstract：? Tissue culture and rapid propagation technique of Calotropis gigantea was studied by using stem segments as explants in this paper. The results showed that the optimal sterilization method of explants was to treat 7 min with 0.1% HgCl2， and the survival rate of explants was 32.3%. The suitable primary induction medium was MS+ sucrose 30 g·L-1+ ager 3.5 g·L-1. And after 20 d culture， 3-4 cm high regenerative buds were formed. Pre-multiplication culture test showed that MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+ sucrose 30 g·L-1+ ager 3.5 g·L-1 was a suitable multiplication medium， and proliferation coefficient was 4.6. However， during the subsequent culture process， the seedlings were easy to vitrify by using this method. With the change of generation， the vitrification rate increased， and it nearly reached 100% on the fourth generation. Therefore， inhibition of vitrification was the key to succeed. Based on the above multiplication culture treatment， with AgNO3 as a vitrification inhibitor， the suitable multiplication culture medium of MS+6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+ AgNO3 1.0 g·L-1+ sucrose 30 g·L-1+ ager 3.5 g·L-1 was verified. With this method， 25 d later， seedling height was 5-8 cm， and proliferation coefficient was higher than 5.8 and vitrification rate of multiple shoots was lower than 10%. The optimal medium for rooting was 1/2MS+ NAA 1.0 mg·L-1+ sucrose 20 g·L-1 + ager 3.6 g·L-1， and 14 d later， the rooting rate was 98%. The rooting seedlings were transplanted in the 70% shading greenhouse. And 30 d later， they were about 20 cm high， with 85% survival rate. This method can be used for the large-scale production of excellent clonal seedlings of Calotropis gigantea.

Key words： Calotropis gigantea， tissue culture， medium

牛角瓜（Calotropis gigantea）為蘿藦科牛角瓜屬灌木，在我國(guó)主要分布于云南、四川、廣西和廣東等地區(qū)，多生長(zhǎng)于低海拔向陽(yáng)山坡、曠野地及海邊，其在干熱河谷、鹽堿地等生境下適應(yīng)能力較強(qiáng)，可起到改善生態(tài)環(huán)境的作用。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)牛角瓜的深入研究，發(fā)現(xiàn)了牛角瓜多種應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。牛角瓜纖維密度為0.9 g·cm-3，是自然界質(zhì)量最輕的纖維（Maity et al.，? 2014）。將牛角瓜纖維與傳統(tǒng)棉纖維和木棉纖維的直徑、長(zhǎng)度和成分對(duì)比發(fā)現(xiàn)，牛角瓜絨的結(jié)構(gòu)類似于木棉纖維且具有更優(yōu)良的機(jī)械性能，牛角瓜絨與棉的混紡紗能夠滿足服飾的基本要求（費(fèi)魏鶴等，2011）。因此，牛角瓜纖維被譽(yù)為繼棉花纖維又一具有廣泛應(yīng)用前景的新型天然植物纖維（李瑞等，2007;費(fèi)魏鶴等，2011;高靜等，2012;方國(guó)平等，2014）。研究證實(shí)，牛角瓜全株富含白色乳汁，有毒但具有藥用價(jià)值。從牛角瓜乳汁中提取的牛角瓜苷等物質(zhì)具有強(qiáng)心作用（鄧士賢等，1962;戴好富等，2009;高柱和王小玲，2011;田湘等，2015）;牛角瓜根及花的提取物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、退熱等作用（Kumar & Basu， 1994;Basu & Chaudhari，1991）;此外，牛角瓜的不同提取物還具有護(hù)肝、促進(jìn)傷口愈合、抗氧化等多種作用（戴好富等，2009）。牛角瓜被稱為“石油植物”，其汁液中含有大量碳?xì)浠衔锛安糠譄N類物質(zhì)，與天然石油成分近似，其汁液中含有多種化學(xué)成分，印度產(chǎn)的牛角瓜植株中油脂含量為4.7%，熱值與原煤接近，被認(rèn)為可用來(lái)開發(fā)液體燃料和有用化學(xué)品（Kalita & Saikia，2004;Sharma et al.， 1997）。由于牛角瓜生長(zhǎng)速度快，每周可長(zhǎng)30 cm，能多茬收獲，生物量大。因此，作為能源植物開發(fā)具有重要意義。綜上所述，經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)外科研工作者的研究證實(shí)，牛角瓜在棉紡織領(lǐng)域、醫(yī)藥領(lǐng)域和生物質(zhì)能源開發(fā)領(lǐng)域等都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

野生牛角瓜主要以種子繁殖為主，基于牛角瓜重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，應(yīng)在篩選優(yōu)良單株的基礎(chǔ)上進(jìn)行無(wú)性繁殖，以保持母本的優(yōu)良性狀。常規(guī)的無(wú)性繁殖方法有扦插、嫁接、組培等，但想要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行快速大量的無(wú)性繁殖，則組培的方法更為快速有效。雖然牛角瓜組培技術(shù)目前已有報(bào)道，但研究相對(duì)較少，且有兩個(gè)影響產(chǎn)業(yè)效率的主要問(wèn)題并未解決：一是牛角瓜組培苗增殖系數(shù)較低，僅為 3.9/25 d（唐軍榮等，2016）;二是牛角瓜組培快繁過(guò)程中極易玻璃化，且隨著繼代次數(shù)的增多，玻璃化加重，最終導(dǎo)致負(fù)增殖。本文針對(duì)這兩方面的問(wèn)題對(duì)牛角瓜組培快繁增殖培養(yǎng)基配方進(jìn)行研究和改進(jìn)，得到該方法。

1材料與方法

1.1 植物材料

2015年9月，采集海南省海尾鎮(zhèn)牛角瓜的當(dāng)年生枝條。

1.2 外植體消毒、接種及初代培養(yǎng)

以牛角瓜當(dāng)年生枝條作為外植體，將外植體置于質(zhì)量濃度為1%的洗潔精水溶液中浸泡10 min，取出后用流水沖洗干凈，再置于超凈工作臺(tái)上用體積濃度為 70%的乙醇浸泡60 s，取出后置于質(zhì)量濃度為0.1%的HgCl2中浸泡滅菌，滅菌時(shí)間選取5 、6 、7和8 min 4個(gè)水平，最后用無(wú)菌水清洗 3～5 次。將經(jīng)過(guò)消毒處理的牛角瓜外植體裁剪成含有1或2個(gè)腋芽的莖段，將莖段接種到MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個(gè)處理30瓶，每瓶接種外植體1個(gè)，重復(fù)3次，每隔1周觀測(cè)記錄材料的生長(zhǎng)狀況并剔除污染材料。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為（28±3）℃，光照時(shí)間為10～12 h·d-1，光照強(qiáng)度為40 μmol·m-2·s-1。

1.3 牛角瓜無(wú)菌芽的增殖培養(yǎng)

將初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中獲得的無(wú)菌幼苗剪成帶有1～2個(gè)腋芽的莖段，接種于含有不同濃度配比的6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中用于固化的瓊脂3.5 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，pH調(diào)至5.8。采取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，6-BA取0.5、1.0、1.5 mg·L-1三個(gè)水平，NAA取0.05、0.1、0.15 mg·L-1三個(gè)水平，每組處理接種60個(gè)莖段，重復(fù)3次，接種之后，每隔10 d觀測(cè)記錄材料的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)25 d后，統(tǒng)計(jì)各個(gè)處理的增殖系數(shù)、長(zhǎng)勢(shì)（葉片顏色、苗高及莖桿的粗細(xì)等）和玻璃化率等。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為（28±3） ℃，光照時(shí)間為10～12 h·d-1，光照強(qiáng)度為40 μmol·m-2·s-1。

1.4 牛角瓜組培苗玻璃化抑制試驗(yàn)

在牛角瓜繼代增殖培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)從第一代開始即出現(xiàn)大量的玻璃化苗，嚴(yán)重影響牛角瓜繼代增殖。以上述篩選出的增殖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選用AgNO3作為玻璃化抑制劑進(jìn)行牛角瓜玻璃化抑制試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)：AgNO3取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1五個(gè)水平，每組處理接種60個(gè)莖段，重復(fù)3次，接種后，培養(yǎng)25 d，統(tǒng)計(jì)各個(gè)處理的增殖系數(shù)、長(zhǎng)勢(shì)（葉片顏色、苗高及莖桿的粗細(xì)等）和玻璃化率等。

利用上述篩選出來(lái)的優(yōu)選培養(yǎng)基進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，每25 d為一代，觀測(cè)每一代的玻璃化率，以確定此優(yōu)選配方是否能夠穩(wěn)定抑制牛角瓜組培苗的玻璃化。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為（28±3） ℃，光照時(shí)間為10～12 h·d-1，光照強(qiáng)度為40 μmol·m-2·s-1。

1.5 牛角瓜組培苗生根培養(yǎng)及煉苗移栽

選擇增殖培養(yǎng)所得的叢生苗和芽苗為生根材料，轉(zhuǎn)入含有不同濃度NAA的1/2MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)基中用于固化的瓊脂3.5 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，pH調(diào)至5.8。試驗(yàn)所用NAA取0.5、1.0、1.5 mg·L-1三個(gè)水平，共設(shè)計(jì)3個(gè)處理，每個(gè)處理20瓶，每瓶接種牛角瓜無(wú)根苗10株，重復(fù)3次得到數(shù)據(jù)。接種后，培養(yǎng)14 d，觀測(cè)統(tǒng)計(jì)各處理幼苗的根數(shù)、根長(zhǎng)、根毛、生根率及植株長(zhǎng)勢(shì)等。

將牛角瓜生根苗置于70%遮陰度的大棚中煉苗3～5 d后，取出并洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于裝有消過(guò)毒的移栽基質(zhì)（沙壤土∶腐殖土=2∶1）的營(yíng)養(yǎng)杯（12 cm × 12 cm）中，在溫室大棚培養(yǎng)30 d后，即可移栽大田。

培養(yǎng)條件：溫度為（28±3） ℃，光照時(shí)間為10～12 h·d-1，光照強(qiáng)度為40 μmol·m-2·s-1。

2結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒、接種與初代培養(yǎng)

牛角瓜外植體經(jīng)消毒滅菌接種于MS培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)3周后對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，隨著升汞滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率逐漸下降，成活率先上升后下降，升汞處理7 min時(shí)成活率最高（表1）。對(duì)初代培養(yǎng)形成的幼苗進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，升汞滅菌5～7 min，培養(yǎng)20 d左右幼苗高度都可以達(dá)到3～4 cm，且植株葉片鮮綠、莖稈相對(duì)較粗，能夠作為增殖培養(yǎng)的無(wú)菌材料;升汞滅菌時(shí)間達(dá)到8 min，部分幼苗莖稈纖細(xì)，腋芽數(shù)少，且葉片發(fā)黃。綜上所訴，牛角瓜外植體升汞最佳滅菌時(shí)間為7 min。

2.2 牛角瓜無(wú)菌芽的增殖培養(yǎng)

以6-BA（0.5～1.5 mg·L-1） 與NAA（0.05～0.15 mg·L-1）不同濃度配比進(jìn)行第一代增殖培養(yǎng)，結(jié)果顯示在培養(yǎng)25 d后，各個(gè)處理組的苗高差異不明顯（圖1）; 增殖系數(shù)處理7（6-BA濃度1.5 mg·L-1、NAA濃度0.05 mg·L-1）最大，達(dá)到4.6，且植株健壯，葉片鮮綠，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)（表2和圖1）。從表2中還可以看出9個(gè)處理的玻璃化率都在30%左右，僅處理7與處理1有顯著差異，但處理1的增殖系數(shù)明顯低于處理7，因此認(rèn)為處理7的組合為牛角瓜較為適宜的增殖培養(yǎng)基。

利用上述篩選出的增殖培養(yǎng)基配方MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1 + 蔗糖30 g·L-1+瓊脂3.5 g·L-1（pH 5.8）對(duì)牛角瓜進(jìn)行增殖擴(kuò)繁，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著繼代次數(shù)的增多，牛角瓜組培苗玻璃化程度加重（圖2），擴(kuò)繁至第四代，幾乎全部玻璃化，因此抑制牛角瓜組培苗玻璃化是其快繁能否成功的關(guān)鍵。

2.3 牛角瓜玻璃化抑制試驗(yàn)

以MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1 + 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂3.5 g·L-1（pH 5.8）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別附加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1的硝酸銀作為玻璃化抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在添加硝酸銀的培養(yǎng)基中5個(gè)處理組的玻璃化率都降低到了10%以下，處理2、3、4、5之間差異不顯著;增殖系數(shù)方面，處理2與處理3之間差異不顯著，兩者和其他處理之間差異顯著（表3）。雖然處理3的增殖系數(shù)更高一些，但其所得的組培苗，莖稈細(xì)弱，葉片卷曲發(fā)黃; 處理2的植株， 莖稈較為粗壯， 葉片鮮綠（表2，圖3）。因此，處理2（MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+ AgNO3 1.0 g·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂3.5 g·L-1）為牛角瓜繼代增殖的合適培養(yǎng)基。

以篩選出的優(yōu)選增殖培養(yǎng)基MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+ AgNO3 1.0 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂3.5 g·L-1來(lái)進(jìn)行連續(xù)多代的增殖培養(yǎng)。從表4可以看出，用此配方進(jìn)行連續(xù)多代的增殖培養(yǎng)，玻璃化率一直維持在8%以下，增殖系數(shù)維持在5.6以上，且各世代之間差異不顯著。

2.4 牛角瓜生根培養(yǎng)與煉苗移栽

將高度4～5 cm的牛角瓜從生芽苗從基部剪下，轉(zhuǎn)入含有不同濃度NAA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1）的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，14 d后觀測(cè)結(jié)果及計(jì)算生根率， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)處理在生根數(shù)方面沒(méi)有顯著差異，而在根長(zhǎng)和生根率方面均差異顯著，處理2生根率最高（達(dá)到98%），且在根長(zhǎng)與生根數(shù)方面都優(yōu)于另外兩個(gè)處理（表5）。因此，確定含有NAA 1.0 mg·L-1的1/2MS培養(yǎng)基為較適宜牛角瓜組培苗生根的培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中，生根苗健壯，長(zhǎng)出的根系潔白、有韌性，利于移栽（圖4）。

將牛角瓜生根苗置于70%遮陰度的大棚中煉苗3～5 d后，取出并洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于裝有消過(guò)毒的移栽基質(zhì)（沙壤土∶腐殖土=2∶1）的營(yíng)養(yǎng)杯（12 cm × 12 cm）中，在溫室大棚培養(yǎng)30 d后，苗高可達(dá)20 cm，成活率為85%。

3討論與結(jié)論

本研究通過(guò)牛角瓜帶腋芽的莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，探索出了一套相對(duì)完整的牛角瓜組織培養(yǎng)和種苗快繁技術(shù)。牛角瓜外植體在進(jìn)行消毒滅菌時(shí)，適宜的升汞滅菌時(shí)間為7 min，消毒存活率相對(duì)較低，為32.33%。可能的原因是牛角瓜屬于多漿植株，新生枝條含有豐富的乳汁且相對(duì)柔弱，用升汞進(jìn)行滅菌時(shí)，剪口不易消毒清洗，圖 1牛角瓜無(wú)菌芽增殖培養(yǎng)表現(xiàn)造成滅菌不徹底，且升汞附著于傷口對(duì)植物體造成傷害。

在牛角瓜的繼代增殖培養(yǎng)研究中，李克烈等（2007）利用牛角瓜葉片愈傷組織誘導(dǎo)芽分化得到了較多的叢生芽;唐軍榮等（2016）利用牛角瓜頂芽為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，增殖系數(shù)最高為3.9。參考二者的研究，本研究對(duì)增殖培養(yǎng)配方進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，通過(guò)連續(xù)的多代培養(yǎng)研究證實(shí)，利用此配方進(jìn)行牛角瓜的增殖快繁，增殖系數(shù)一直維持在5.6以上，相比于二者，增殖系數(shù)有了明顯的提高。另外，在牛角瓜增殖快繁過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，未加入玻璃化抑制劑時(shí)，牛角瓜組培苗極易玻璃化，在研究過(guò)程中，僅培養(yǎng)到第四代，幾乎全部因?yàn)椴ＡЩ劳?。針?duì)這一問(wèn)題，該研究利用硝酸銀作為玻璃化抑制劑，研究篩選MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+AgNO3 1.0 mg·L-1 +蔗糖30 g·L-1+瓊脂3.6 g·L-1為適宜的增殖培養(yǎng)基。此配方在未加入硝酸銀時(shí)，增殖系數(shù)能夠達(dá)到4.6;添加1.0 mg·L-1的硝酸銀后，玻璃化率由33.9%降低到了6.11%，增殖系數(shù)由4.6增加到5.8，且連續(xù)多代培養(yǎng)，玻璃化率一直維持在8%以下，各世代之間差異不顯著。應(yīng)用此方法解決牛角瓜組培苗易玻璃化的同時(shí)維持牛角瓜增殖培養(yǎng)較高的增殖系數(shù)，為牛角瓜高效低成本的種苗組培快繁創(chuàng)造了有利條件。

在對(duì)牛角瓜組培苗生根培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在含NAA的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，根長(zhǎng)可達(dá)4～5 cm，生根數(shù)為5～8，生根率98%，但在移栽過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，牛角瓜組培苗根系相對(duì)柔弱、根毛少，在進(jìn)行清洗時(shí)很容易造成斷裂，這可能是影響后期移栽成活率的主要原因。因此，在進(jìn)行生根培養(yǎng)時(shí)，在保證牛角瓜生根率的同時(shí)，應(yīng)采取合適的方法健壯牛角瓜根系。

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