周海亮 周興 李波男 周青 何清湖

〔摘要〕 目的 研究雄蠶益腎方對腎陽虛大鼠抗氧化作用及睪丸Bcl-2 、Cyt-c蛋白表達的影響。方法 取雄性SD大鼠40只，隨機分成正常組10只、造模組30只。造模組予200 mg/kg腺嘌呤混懸液造腎陽虛模型成功后，隨機分為模型組、左卡尼汀組、雄蠶益腎組，正常組與模型組給予生理鹽水灌胃，其他組分別給予相應藥物連續(xù)灌胃，4 mL/d。4周后檢測睪丸組織SOD、MDA、GSH-Px及血清性激素相關指標，免疫組化法測定睪丸Bcl-2、Cyt-c蛋白表達情況，取兩側睪丸做常規(guī)病理切片分析。結果 與模型組相比，雄蠶益腎方組睪丸GSH-PX、SOD、血清T、E2濃度顯著升高（P<0.01），睪丸MDA濃度明顯降低（P<0.05），雄蠶益腎方組睪丸Bcl-2 蛋白陽性表達率明顯升高（P<0.01），Cyt-c 蛋白陽性表達率明顯降低（P<0.01）;與模型組相比，雄蠶益腎方組睪丸生精上皮尚比較完整，組織內生精小管內可見精母細胞，生精小管內仍有大量精子生成，管腔可見大量精子。結論 雄蠶益腎方能提高腎陽虛大鼠睪丸組織抗氧化作用，調節(jié)生精細胞凋亡，這可能是其調節(jié)生精功能的機制之一。

〔關鍵詞〕 雄蠶益腎方;腎陽虛;抗氧化作用;生精功能

〔中圖分類號〕R285.5;R698 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.12.003

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Xiongcan Yishen formula on antioxidant effect and expression of testicular bcl-2 and Cyt-c protein in rats with kidney-Yang deficiency. Methods A total of 40 male SD rats were randomly divided into a normal group （n=10） and a model group （n=30）. After successful modeling of kidney-Yang deficiency model by giving 200 mg/kg adenine suspension to the model group， and they were randomly divided into the model group， levocarnitine group and Xiongcan Yishen formula group. The normal group and the model group were given normal saline by gavage， and the other groups were given continuous gavage with corresponding drugs， 4 mL/d. After 4 weeks， SOD， MDA， gsh-px and serum sex hormone related indicators in testicular tissue were detected， and the expressions of Bcl-2 and Cyt-c proteins in testicle were determined by immunohistochemistry. Routine pathological sections of both sides of testicle were taken for analysis. Results Compared with the model group， GSH-Px， SOD， serum T and E2 concentrations were significantly increased in the Xiongcan Yishen formula group （P<0.01）， and MDA concentrations were significantly decreased （P<0.05）. The positive expressions of Bcl-2 proteins were significantly increased （P<0.01）， and the positive expression rate of Cyt-c protein was significantly reduced in the Xiongcan Yishen formula group （P<0.01）. Compared with the model group， the spermatogenic epithelium of the testis in the Xiongcan Yishen formula group was relatively complete. Spermatogonial cells could be seen in the spermatogonial tubules in the tissue， and there were still a lot of spermatogenesis in the spermatogonial tubules， and a lot of spermatozoa could be seen in the lumen. Conclusion Xiongcan Yishen formula can improve the antioxidant effect of the testicular tissue and regulate the apoptosis of spermatogenic cells in rats with kidney-Yang deficiency， which may be one of the mechanisms of regulating spermatogenic function.

〔Keywords〕 Xiongcan Yishen Formula; Kidney-Yang deficiency; antioxidation; sperm production function

活性氧（ROS）是有氧代謝的活性副產物，在急性或慢性炎癥的情況下，抗氧化系統平衡失衡導致ROS生成增加，最終導致氧化應激[1]。當機體發(fā)生氧化應激反應時，過量的ROS就會影響精子DNA結構，使抗氧化物酶基因表達減少，抗氧化作用減弱，并產生細胞脂質過氧化物丙二醛，從而誘導睪丸組織超微結構損傷。越來越多實驗研究證明，線粒體是細胞凋亡的調控中心[2]，即生精細胞線粒體膜脂質和蛋白受到破壞，促使生精細胞凋亡，影響男性生精功能。雄蠶益腎方為湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院男科驗方，能溫腎填精，為陰陽雙補之劑。本課題前期研究已證明，雄蠶益腎方可促進大鼠雄性激素的分泌，且效果優(yōu)于常規(guī)的睪酮補充治療，在一定程度上有類似睪酮的功能，能作用于下丘腦-垂體-性腺軸（HPG），對雄性激素的分泌產生良性影響，并且通過降低睪丸間質細胞（Leydig）線粒體水腫及細胞自噬，改善其睪丸組織病理變化和睪丸間質細胞超微結構而發(fā)揮作用[3-4]。本研究采用經典腎陽虛造模法腺嘌呤溶液灌胃大鼠誘導腎陽虛模型，以雄蠶益腎方為研究對象，系統研究該方對腎陽虛模型大鼠睪丸抗氧化作用及調節(jié)生精功能分子機制。

1 材料和方法

1.1 ?實驗動物及材料

選取SPF級雄性SD大鼠，8周齡，體質量（220±20）g，共50只，（購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物使用許可證號：SCXK（湘）2016-0002，質量合格證編號：43004700052345。雄蠶益腎方（雄蠶蛾30 g，淫羊藿15 g，熟地黃15 g，枸杞子15 g，白芍10 g，刺蒺藜15 g），由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院天江顆粒藥房購買顆粒配方，加蒸餾水溶解，濃縮成生藥濃度為1 g/mL藥液。左卡尼汀口服溶液，規(guī)格10 mL/g，（批號：180912），東北制藥總廠;腺嘌呤（批號：131203），上海伯奧生物技術有限公司。

1.2 ?主要儀器及試劑

352型Elisa酶標儀，芬蘭;AC8洗板機，芬蘭;TG16W微量高速離心機，湖南邁達儀器有限公司;GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海恒勤儀器設備有限公司。JJ12-J脫水機，JB-P5包埋機，JB-L5凍臺，均來自武漢俊杰電子有限公司;RM2016病理切片機，上海徠卡儀器有限公司;KD-P組織攤片機，浙江省金華市科迪儀器設;Nikon EclipseE100正置光學顯微鏡，日本尼康;Nikon DS-U3成像系統，日本尼康。

睪酮（Testosteron，T） ELISA試劑盒（貨號：MM-0577R2）、雌二醇（Estradiol，E2） ELISA試劑盒（貨號：MM-0575R2）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA試劑盒（貨號：MM-0386R2）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）ELISA試劑盒（貨號：MM-0385R2）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）ELISA試劑盒（貨號：MM-20251R2）、17-羥皮質類固醇（17-OHCS）ELISA試劑盒（批號：14020812），以上試劑盒均來自江蘇晶美生物科技有限公司。Bcl-2抗體（貨號：OM123485），上海斯信生物科技有限公司，Cyt-c抗體（貨號：OM241170），上海斯信生物科技有限公司。蘇木素染液套裝（貨號：G1004），武漢谷歌生物科技有限公司;二甲苯（批號：10023418），國藥集團化學試劑有限公司;中性樹膠（貨號：G1403），國藥集團化學試劑有限公司;EDTA（pH 8.0）抗原修復液（貨號：G1206）;EDTA（pH 9.0）抗原修復液（貨號：G1203）;牛血清白蛋白（BSA）（貨號：G5001），均來自谷歌生物;正常兔血清（貨號：AR1010），博士德公司;組化試劑盒DAB顯色劑（貨號：K5007），DAKO公司。

1.3 ?動物造模、分組及干預

予200 mg/kg腺嘌呤混懸液灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃21 d造模腎陽虛模型[5]。造模完成后，收集24 h尿液，控制溫度在4 ℃左右，以2 000 r/min離心5 min，取上清液;采用ELISA法檢測尿17-羥皮質類固醇（17-OHCS）含量可作為腎陽虛證模型大鼠的客觀指標[6]。參考文獻[5]統計正常組10只大鼠尿17-OHCS含量為45.58 μg/L，以此為切點值，再結合大鼠的癥狀體征：畏寒、四肢發(fā)涼、小便清長量多、大便稀溏、活動減少、體毛疏松等腎陽虛證癥狀;檢測模型組大鼠24 h尿17-OHCS含量低于切點值45.58 μg/L，合并有腎陽虛證癥狀則可認為造模成功。

按隨機數字表法，從40只大鼠隨機抽取10只為正常對照組大鼠，其余大鼠按上述造模方法造模成功后，按體質量不同，根據隨機數字表將30只模型大鼠分為3組：左卡尼汀組、雄蠶益腎方組及模型組。于造模成功后的第2天開始分別給予相應藥物連續(xù)灌胃28 d，大鼠給藥量按人與大鼠體表面積等效換算以確定灌胃劑量[7]，以成人（70 kg）和大鼠（200 g）等效系數（6.17）計算各組動物相應每日給藥劑量，雄蠶益腎方組8.8 g/kg、左卡尼汀組0.2 g/kg，灌胃1次/d。模型組、正常組予以0.9%氯化鈉溶液連續(xù)灌胃，灌胃量為4 mL/d。各組大鼠每周測量體質量以調整給藥劑量，連續(xù)給藥4周。在給藥第28天后，以10%的水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠，腹主動脈采血，采血后摘取大鼠雙側睪丸組織。

1.4 ?血清性激素T、E2及一側睪丸組織均漿SOD、MDA、GSH-Px含量測定

取全血標本于室溫下靜置2 h，1 000 r/min離心 20 min，取上清待測。取單側睪丸組織剪碎，用4 ℃、0.9%的生理鹽水在冰水浴中制成10%的組織勻漿，將勻漿3 000 r/min離心10 min，取上清液。嚴格按各標本試劑盒說明書進行檢測（各試劑盒Elisa酶標儀檢測單波長為450 nm）。

1.5 ?免疫組化法檢測睪丸組織Bcl-2和CytC蛋白表達水平

取睪丸組織，將固定的標本石蠟切片脫蠟，蒸餾水洗，然后將組織切片置于檸檬酸抗原修復緩沖液（pH 6.0）中進行抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶后在組化圈內滴加3%BSA室溫封閉30 min。然后甩掉封閉液，滴加PBS按一定比例配好的一抗（一抗是山羊來源的用兔血清封閉，其他來源的用BSA封閉），切片稍甩干后繼續(xù)滴加與一抗相應種屬的二抗（HRP標記）覆蓋組織;隨即滴加DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，終止顯色后用蘇木素復染3 min左右，最后脫水封片，用顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。免疫組化平均光密度值（MeanDensity）分析方法：應用Image-ProPlus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值（IOD）以及組織的像素面積（AREA）。并求出平均光密度值IOD/AREA（Mean Density）。

1.6 ?統計學分析

計量資料用“x±s”表示，采用SPSS 21.0軟件進行數據整理、篩選與統計分析，經正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗后，若符合正態(tài)分布，多組間比較采用單因素方差分析;若不符合正態(tài)分布，則采用非參數檢驗。其中P<0.05具有統計學意義，P<0.01則具有顯著的統計學意義。

2 結果

2.1 ?各組大鼠癥狀體征觀察

除正常組外，其它各組大鼠均于造模后逐漸活動減少，反應遲鈍神情困頓，胡須下垂畏寒倦臥，體毛疏松泛黃失去光澤，飲食量減少，便溏多尿等腎精虧虛表現。造模完成后，干預2周左右實驗組大鼠上述癥狀體征開始恢復，雄蠶益腎方組最明顯，模型組無明顯變化。

2.2 ?各組大鼠睪丸組織 MDA、SOD、GSH-Px濃度比較

與正常組相比，模型組MDA濃度顯著升高，而SOD、GSH-Px濃度明顯降低，差異性有統計學意義（P<0.01）;與模型組相比，雄蠶益腎方組SOD、GSH-Px濃度顯著升高（P<0.01），MDA濃度明顯降低（P<0.01），左卡尼汀組與模型組相比SOD濃度升高（P<0.05），GSH-Px濃度明顯升高，MDA濃度降低（P<0.05）。見表1。

2.3 ?各實驗組大鼠血清T、E2濃度水平比較

與正常組相比，模型組血清T、E2濃度顯著降低（P<0.01），T/E2值明顯下降（P<0.05）;與模型組相比，雄蠶益腎方組T濃度顯著升高（P<0.01），左卡尼汀組T濃度明顯升高（P<0.05），差異均有統計學意義。與模型組相比，左卡尼汀組、雄蠶益腎方組E2濃度升高（P<0.01），差異性均有統計學意義。與模型組相比，雄蠶益腎方組、左卡尼汀組T/E2值明顯上升（P<0.01），如表2所示。

2.4 ?睪丸常規(guī)病理切片

正常組睪丸組織切片結果，睪丸組織中丸生精上皮完整，生精小管內可見精原細胞有序排列在小管邊緣;各級精母細胞逐層排列，管腔內可見大量精細胞;組織形態(tài)結構正常，未見明顯病理變化，見圖1A;模型組睪丸組織切片結果，睪丸組織內可見生精上皮層次明顯減少，結構紊亂，部分生精小管間隙增大，管腔內精母細胞數量減少，細胞排列疏松，如黑色箭頭所示;組織內生精小管生精障礙，生成精細胞數量顯著減少，如藍色箭頭所示，見圖1B;左卡尼汀組睪丸組織切片結果，睪丸組織內部分生精小管內可見有精母細胞數量，但細胞排列疏松;組織內部分生精小管生精障礙，生成精細胞數量減少，如藍色箭頭所示，見圖1C;雄蠶益腎方組睪丸組織切片結果與正常組相似，生精上皮尚比較完整，雖然各級生精細胞排列稍為紊亂，組織內生精小管內可見精母細胞，生精小管內仍有大量精子生成，管腔可見大量精子，而絕對數量均少于正常組，見圖1D。

2.5 ?各組大鼠睪丸組織Bcl-2、Cyt-c蛋白表達水平比較

與正常組相比，模型組睪丸Bcl-2蛋白陽性表達顯著降低（P<0.01），Cyt-c蛋白陽性表達顯著升高（P<0.01）;雄蠶益腎方組、左卡尼汀組與模型組相比丸Bcl-2蛋白陽性表達顯著升高（P<0.01），Cyt-c蛋白陽性表達明顯降低（P<0.01），如表3所示。與模型組相比，雄蠶益腎組大鼠精母細胞、精子細胞及精子中有大量Bcl-2陽性細胞，如圖2，Cyt-c蛋白陽性表達減少，如圖3。

3 討論

目前研究表明，選用腺嘌呤造模腎陽虛模雄性大鼠型，可以誘導睪丸超微結構發(fā)生氧化損傷[5]，同時出現神情困頓，胡須下垂畏寒倦臥，體毛疏松泛黃失去光澤，食量減少，便溏多尿，尾巴濕冷等中醫(yī)學中的腎陽虛表現，與人類腎陽虛證表現相似，故選用腺嘌呤造模腎陽虛證大鼠。

睪丸組織內適量自由基的產生對其生理活動起著積極作用，但若ROS生成過量不能及時清除，抗氧化系統失衡，繼而發(fā)生氧化應激反應，作為自由基連鎖反應的最終產物MDA，其含量直接反映了機體的脂質過氧化程度及自由基的代謝狀況[8]。在生殖系統中存在抗氧化系統抑制氧化應激，減少氧化損傷，主要有超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化（GSH-Px）等。其中SOD將超氧化物陰離子轉化為H2O2和O2，是維持機體抗氧化系統內最重要的抗氧化酶，GSH-Px對活性氧和組織產生的H2O2有較強的清除能力，對保護生物膜結構和功能完整有重要作用[9]。本研究結果顯示，與模型組相比，雄蠶益腎方組SOD、GSH-PX濃度顯著升高（P<0.01），MDA濃度顯著降低（P<0.01），表明雄蠶益腎方對睪丸組織具有抗氧化作用。

已有研究證實，氧化應激反應可誘導線粒體腫脹，從而使線粒體膜的通透性和完整性受到破壞，當線粒體接收到凋亡刺激信號，會通過釋放內外膜間隙里的一些促凋亡因子，如Cyt-c等，進一步激活下游凋亡通路;Bcl-2屬于Bcl-2家族里面的抑凋亡蛋白，位于線粒體外膜上，可以通過抑制Bax孔道的形成抑制凋亡。實驗表明，Cyt-c從線粒體內、外膜間隙釋放到胞漿是細胞凋亡的關鍵步驟，而在Cyt-c釋放的過程中，線粒體外膜的Bcl-2家族蛋白和線粒體通透性轉換起決定作用[10]。本研究發(fā)現，模型組睪丸生精細胞線粒體受到氧化損傷后Bcl-2蛋白陽性表達顯著降低（P<0.01），Cyt-c蛋白陽性表達顯著升高（P<0.01），與上述研究結果一致;雄蠶益腎方組與模型組相比睪丸Bcl-2蛋白陽性表達顯著升高（P<0.01），Cyt-c蛋白陽性表達明顯降低（P<0.01），說明雄蠶益腎方具有調節(jié)生精細胞凋亡的功效。本實驗前期研究證明，T合成過程中，睪丸間質細胞（Leydig）線粒體是最關鍵細胞器之一，雄蠶益腎方能提高大鼠血清T水平，顯著降低Leydig細胞線粒體水腫發(fā)生[4]。有研究發(fā)現，一定量E2可以抑制體外生精細胞的凋亡調節(jié)男性正常生殖功能，又被稱為生精細胞的存活因子[11-12]。若血循環(huán)中的雌激素水平過高，E2可促進中樞神經系統阿片類物質合成，進而抑制放促性腺激素釋放激素（GnRH）脈沖的幅度來抑制垂體促性腺激素的釋放，減少FSH和LH合成[13-14]，影響Leydig合成T，不利于精子的生成。本實驗研究表明，與正常組相比，模型組血清T、E2濃度明顯降低（P<0.01），T/E2值下降（P<0.05），雄蠶益腎方組與模型組相比血清T、E2濃度明顯升高（P<0.01），T/E2值上升（P<0.05），說明雄蠶益腎方能提高血清T水平，并維持相對穩(wěn)定高濃度的雄激素環(huán)境，有利于生精細胞成熟。

本實驗研究表明，雄蠶益腎方能夠通過提高睪丸組織的抗氧化作用，降低Leydig線粒體氧化損傷，調節(jié)生精細胞凋亡，提高睪酮水平，維持良好的生精環(huán)境，改善模型大鼠生精功能。

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