鄧霖芳　袁帥　劉江云

中圖分類(lèi)號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）16-2226-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.13

摘 要 目的：建立博落回提取物中血根堿的離子交換樹(shù)脂分離純化工藝。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定博落回提取物中血根堿含量，色譜柱為Cosmosil C18-R-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%醋酸溶液（25 ∶ 75，V/V），流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。通過(guò)靜態(tài)吸附與解吸附試驗(yàn)，對(duì)比8種離子交換樹(shù)脂對(duì)血根堿的吸附和解吸附性能;采用優(yōu)選離子交換樹(shù)脂，考察最佳上樣液濃度、上樣pH值以及上樣體積;采用APPS 10D液相制備系統(tǒng)，考察動(dòng)態(tài)洗脫條件，獲得博落回精提物溶液;采用反相C18色譜柱對(duì)博落回精提物溶液脫鹽、洗脫并干燥，獲得精制純化物。采用HPLC法測(cè)定所得精制純化物的純度，并采用HPLC法、紫外分光光度法、質(zhì)譜法、核磁共振法分別對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。結(jié)果：篩選獲得CM-FF型樹(shù)脂用于博落回提取物中血根堿的分離純化，以含20%甲醇、0.25 mol/L氯化鈉的20 mmol/L醋酸銨溶液100 mL進(jìn)行洗脫。優(yōu)化的動(dòng)態(tài)吸附條件為上樣濃度6.0 mg/mL、上樣pH值5.5、上樣體積25 mL;洗脫精提物經(jīng)脫鹽和精制后，最終獲得純度為97%的精制純化產(chǎn)物（純化收率為71%），并經(jīng)結(jié)構(gòu)確證其為血根堿。結(jié)論：優(yōu)選的離子交換樹(shù)脂分離純化工藝綠色環(huán)保、安全高效、易于操作，可用于博落回提取物中血根堿單體的分離純化，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞 博落回;血根堿;離子交換樹(shù)脂;分離;純化

Study on Separation and Purification Technology of Sanguinarine from the Extract of Macleaya cordata by Ion Exchange Resin

DENG Linfang1，YUAN Shuai2，3，LIU Jiangyun2（1. Dept. of Pharmacy， the Third Affiliated Hospital of Zhejiang? Chinese Medical University， Hangzhou 310005， China; 2. School of Pharmacy， Soochow University， Jiangsu Suzhou 215123， China; 3. Dept. of Pharmacy， Wuxi Hospital of TCM， Jiangsu Wuxi 214071， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the separation and purification technology of sanguinarine from the extract of Macleaya cordata with ion exchang resin. METHODS： The content of sanguinarine from the extract of M. cordata was determined by HPLC， with? Cosmosil C18-R-Ⅱ column （250 mm×4.6 mm，5 μm）， mobile phase of acetonitrile-0.2% acetic acid solution （25 ∶ 75，V/V）， the flow rate of 1 mL/min， detection wavelength of 270 nm， column temperature of 30 ℃， and sample size of 20 μL. Static adsorption and desorption tests were carried out to compare the adsorption and desorption properties of 8 ion exchange resins for sanguinarine. The optimum concentration of sample solution， pH value and volume of sample were investigated by optimum ion exchange resin. APPS 10D liquid phase preparation system was used to investigate the dynamic elution conditions and obtain M. cordata refined extract solution. The refined purified product of M. cordata was obtained by desalination， elution on a reversed-phase （RP） C18 column and drying.? The purity of the purified product was analyzed by HPLC. The structure of the purified product was confirmed by HPLC， UV spectrophotometry， MS and NMR. RESULTS： CM-FF resin was screened for the separation and purification of sanguinarine from M. cordata extract. It was eluted with 20 mmol/L ammonium acetate solution 100 mL containing 20% methanol and 0.25 mol/L sodium chloride. The optimal dynamic absorption condition included that the concentration of sample was 6.0 mg/mL at pH 5.0，and the loading amount was 25 mL; after desalination and refinement， for the eluted refined extract， the purified product with 97% purity （purified yield? of 71%） was obtained， and its structure was confirmed to be sanguinarine. CONCLUSIONS： The optimal separation and purification technology by ion exchange resin is green， safe， efficient and easy to operate， which can be used for the separation and purification of sanguinarine from M. cordata extract and is suitable for industrial production.

KEYWORDS? ?Macleaya cordata; Sanguinarine; Ion exchange resin; Separation; Purification

博落回[Macleaya cordata （Willd） R.Br.]是罌粟科博落回屬多年生草本植物，全草入藥，在我國(guó)主要集中分布于江蘇、浙江、云南、貴州、湖南、湖北、廣西、廣東及臺(tái)灣等地區(qū)[1]。博落回富含生物堿，至今已被分離并鑒定的單體生物堿達(dá)74個(gè)，其中含量最高且生物活性較強(qiáng)的為苯并異喹啉類(lèi)生物堿，主要包括血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿和別隱品堿等[2-6]。其中，血根堿具有明顯的抗菌、抗腫瘤以及保肝護(hù)肝等藥理活性[7-12]。在歐美和日本等發(fā)達(dá)國(guó)家，血根堿常作為抗菌藥物的替代品被廣泛用于畜牧業(yè)及魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖[13-14]。目前，我國(guó)對(duì)于高純度的血根堿尚無(wú)便捷、高效的規(guī)?；蛛x純化方法。盡管大孔吸附樹(shù)脂法用于提取純化黃酮類(lèi)及內(nèi)酯酮類(lèi)天然產(chǎn)物有著優(yōu)異的表現(xiàn)[15-16]，但由于血根堿及其類(lèi)似物獨(dú)特的苯并雜原子共軛體系結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其化學(xué)性質(zhì)特殊[13]，使用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)其進(jìn)行純化時(shí)需使用大量的甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，造成純化成本高、難于規(guī)模化生產(chǎn)。生物堿成分在中性或酸性條件下以正離子形式存在，可采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行富集分離。離子交換樹(shù)脂商品化已數(shù)十年，其質(zhì)量可靠、成本較低、環(huán)境污染小，近些年越來(lái)越多的應(yīng)用于黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)等天然產(chǎn)物的分離純化[17]。因本研究目標(biāo)產(chǎn)物血根堿為季銨型生物堿[13]，采用離子交換樹(shù)脂柱進(jìn)行純化分離具有一定優(yōu)勢(shì)。因此，本研究旨在開(kāi)發(fā)一種高效的離子交換工藝，用于制備高純度的血根堿，為后續(xù)該生物堿的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)奠定工藝基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Agilent公司）;APPS10D型制備液相色譜儀、Φ15 mm型GCC可壓縮玻璃柱（蘇州利穗科技有限公司）;ME215S型電子天平、PB-10型pH計(jì)（德國(guó)Sartorius公司）;MP2002型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）;N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）;SHZ-82型恒溫振蕩器（金壇市富華儀器有限公司）;DZF型電熱恒溫真空干燥箱（上海邁捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;Simplicity UV型超純水機(jī)（德國(guó)Millipore公司）;KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

血根堿對(duì)照品[本實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20170501，純度：97.1%（按HPLC測(cè)定、歸一化法計(jì)算）];CM-FF型弱陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、SP-HP型強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂[博格?。ㄉ虾＃┥锛夹g(shù)有限公司];CGC100×4型弱陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、PCG600F型反相樹(shù)脂、PCG900F型反相樹(shù)脂[漂萊特（中國(guó)）有限公司];S40型強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（蘇州賽分科技有限公司）;PIPO-02型大孔吸附樹(shù)脂（廣州牌牌生物科技有限公司）;SP50型強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（蘇州知益微球科技有限公司）;C18制備級(jí)填料（75 μm，日本Cosmosil公司）;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 藥材

博落回藥材購(gòu)自湖南，經(jīng)蘇州大學(xué)藥學(xué)院陸葉副教授鑒定為罌粟科植物博落回（Macleaya cordata）的果莢。

2 方法與結(jié)果

2.1 血根堿的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Cosmosil C18-R-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.2%醋酸溶液（25 ∶ 75，V/V）;流速：1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。在該色譜條件下，血根堿與相鄰峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)大于5 000（圖略）。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定血根堿對(duì)照品12.86 mg，置于50 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）使其完全溶解后定容，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取“2.2”項(xiàng)下制備的博落回提取物樣品25.48 mg，置于50 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲使其完全溶解后定容，即得。

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，以甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，制得系列質(zhì)量濃度的線(xiàn)性對(duì)照品溶液。取上述稀釋溶液與原未經(jīng)稀釋的對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。以血根堿質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為：y=101.07x-398.04（r=0.999 2，n=3）。結(jié)果表明，血根堿質(zhì)量濃度在25.72～257.2 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.4”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為154.3 μg/mL的線(xiàn)性對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，血根堿峰面積的RSD為1.07%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時(shí)，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，血根堿峰面積的RSD為1.53%（n=5），表明供試品溶液于室溫下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的博落回提取物樣品12 mg，共6份，精密稱(chēng)定，分別加入質(zhì)量濃度為1.528 mg/mL對(duì)照品溶液（按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備）2 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算含量并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為98.2%（RSD=1.06%，n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 博落回提取物的制備及含量測(cè)定

按照文獻(xiàn)[18]方法，取博落回藥材10 kg，粉碎，用pH 2～3的稀硫酸溶液提取，過(guò)濾，濾液以100 mmol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH至10～12，靜置，過(guò)濾，真空低溫干燥，得博落回提取物120 g。按“2.1”項(xiàng)下方法，取該提取物樣品制備供試品溶液并測(cè)定，結(jié)果所得提取物中血根堿的含量為24.49%，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 博落回提取物中血根堿的離子交換樹(shù)脂純化工藝考察

2.3.1 上樣溶液的制備 稱(chēng)取“2.2”項(xiàng)下制備的博落回提取物樣品500 mg，置于250 mL量瓶中，加入甲醇50 mL，超聲使其溶解后，以20 mmol/L醋酸銨溶液定容至刻度，即得。

2.3.2 解吸附液的制備 量取甲醇50 mL，置于250 mL量瓶中，加入氯化鈉7.32 g、20 mmol/L醋酸銨溶液適量，超聲使氯化鈉溶解后，以20 mmol/L醋酸銨溶液定容至刻度，即得。

2.3.3 離子交換樹(shù)脂種類(lèi)篩選 采用靜態(tài)吸附與解吸附試驗(yàn)進(jìn)行篩選。（1）靜態(tài)吸附試驗(yàn)。稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理的不同種類(lèi)樹(shù)脂（CM-FF、SP-HP、CGC100×4、PCG600F、PCG900F、S40、PIPO-02、SP50）各2 g，分別置于50 mL錐形瓶中，均精密加入“2.3.1”項(xiàng)的上樣溶液20 mL，室溫下以120 r/min振蕩吸附3 h;精密吸取上層清液1 mL，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，以含有20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液定容至刻度。取該溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樹(shù)脂吸附前后上樣液中血根堿的質(zhì)量濃度，并按公式計(jì)算樹(shù)脂的靜態(tài)飽和吸附量：靜態(tài)飽和吸附量（mg/g）=（吸附前血根堿的初始質(zhì)量濃度-吸附飽和后血根堿的質(zhì)量濃度）×吸附液體積/樹(shù)脂稱(chēng)樣量。（2）解吸附試驗(yàn)。將吸附飽和的各樹(shù)脂分別轉(zhuǎn)移至50 mL錐形瓶中，以水洗滌3次，加入“2.3.2”項(xiàng)的解吸附液20 mL，室溫下以120 r/min振蕩吸附5 h;精密吸取上層清液1 mL，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，以含有20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液定容至刻度。取該溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算解吸附液中血根堿的質(zhì)量濃度，并按公式計(jì)算解吸附量及解吸附率：解吸附量=解吸附液中血根堿質(zhì)量濃度×解吸附液體積，解吸附率（%）=解吸液中血根堿質(zhì)量濃度×解吸液體積/靜態(tài)飽和吸附量×100%，結(jié)果見(jiàn)表1（注：表中“-”表示未在解吸附液中測(cè)得血根堿，提示該成分在此解吸附液條件下未能從樹(shù)脂上洗脫）。

由表1可見(jiàn)，CM-FF、SP-HP型號(hào)的樹(shù)脂對(duì)血根堿的解吸附量及解吸附率明顯高于其他類(lèi)型的樹(shù)脂;其他類(lèi)型的樹(shù)脂雖然靜態(tài)飽和吸附量更高，但解吸附性能較差，尤其是PIPO-02型號(hào)的大孔樹(shù)脂，在試驗(yàn)洗脫條件下無(wú)法解吸附血根堿，這一結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道[19]一致。而綜合考慮靜態(tài)吸附和解吸附參數(shù)后認(rèn)為，CM-FF型樹(shù)脂較SP-HP型樹(shù)脂對(duì)血根堿的吸附與洗脫性能更優(yōu)，因此本研究選取CM-FF型樹(shù)脂作進(jìn)一步工藝參數(shù)考察。

2.3.4 CM-FF型樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附條件考察 （1）博落回提取物上樣液質(zhì)量濃度考察。精密稱(chēng)取5份等質(zhì)量的CM-FF型樹(shù)脂適量，濕法裝填，制得柱床體積（BV）為20 mL的離子交換制備柱。取5份“2.2”項(xiàng)下制備的博落回提取物各適量，以含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液制成質(zhì)量濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL的溶液。分別取上述溶液30 mL，以5 mL/min的流速上樣，收集流出液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定血根堿質(zhì)量濃度，根據(jù)公式計(jì)算CM-FF型樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附量[動(dòng)態(tài)吸附量（mg）=（吸附前血根堿的質(zhì)量濃度×吸附前藥液體積）-（吸附后血根堿的質(zhì)量濃度×吸附后藥液體積）]。結(jié)果，當(dāng)博落回提取物的上樣液質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL時(shí)，動(dòng)態(tài)吸附量達(dá)峰值36.46 mg;而隨著博落回提取物質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加，動(dòng)態(tài)吸附量反而下降（見(jiàn)圖2A）。因此，本研究確定博落回提取物上樣液質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL。

（2）上樣pH值考察。精密稱(chēng)取8份等質(zhì)量的CM- FF型樹(shù)脂適量，按“（1）”項(xiàng)下方法裝填離子交換制備柱。配制含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液8份，分別用醋酸調(diào)整pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，并以上述溶液分別對(duì)柱床進(jìn)行平衡。另取8份“2.2”項(xiàng)下制備的博落回提取物適量，以含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液制成質(zhì)量濃度均為6.0 mg/mL的溶液。分別取上述溶液30 mL，以醋酸調(diào)整至相應(yīng)pH值后，以5 mL/min流速上樣，收集流出液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定血根堿質(zhì)量濃度，并按“（1）”項(xiàng)下方法計(jì)算CM-FF型樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附量。結(jié)果，當(dāng)上樣pH為5.5時(shí)，動(dòng)態(tài)吸附量達(dá)峰值37.04 mg;當(dāng)上樣pH過(guò)低或過(guò)高時(shí)，樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附量均有所下降（見(jiàn)圖2B）。因此，本研究確定博落回提取物溶液上樣pH值為5.5。

（3）上樣體積考察。精密稱(chēng)取CM-FF樹(shù)脂適量，按“（1）”項(xiàng)下方法裝填離子交換制備柱，并采用2 BV含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液（pH調(diào)至5.5）對(duì)柱床進(jìn)行平衡。取“2.2”項(xiàng)下制備的博落回提取物適量，以含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液制成質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL的溶液。取該溶液50 mL，以5 mL/min流速上樣，每5 mL收集1次流分，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定血根堿質(zhì)量濃度。以流分編號(hào)為橫坐標(biāo)、流分中血根堿質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制動(dòng)態(tài)泄露曲線(xiàn)（見(jiàn)圖2C）。結(jié)果表明，從6號(hào)流分開(kāi)始出現(xiàn)明顯泄露現(xiàn)象（即可檢出血根堿成分），因此確定6.0 mg/mL的博落回提取物溶液的上樣體積為25 mL。

2.3.5 博落回提取物的動(dòng)態(tài)洗脫條件考察 采用APPS 10D型液相制備系統(tǒng)實(shí)時(shí)在線(xiàn)監(jiān)測(cè)進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫條件考察。根據(jù)“2.3.3”項(xiàng)下方法及考察結(jié)果，稱(chēng)取CM-FF樹(shù)脂適量，裝填BV為20 mL的離子交換制備柱。配制含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液（pH調(diào)至5.5）作為洗脫液A相，配制含20%甲醇、0.5 mol/L氯化鈉的20 mmol/L醋酸銨溶液（pH調(diào)至5.5）作為洗脫液B相。采用2BV的A相對(duì)柱床進(jìn)行平衡;將質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL的博落回提取物溶液（以A相為溶劑配制），以5 mL/min流速上樣5 min。先以A-B混合相（B相體積比為2%）、流速為5 mL/min進(jìn)行洗脫，得制備液相色譜圖（見(jiàn)圖3）。結(jié)果顯示，從17 min開(kāi)始，洗脫液色譜圖中出現(xiàn)明顯紫外吸收，表明有成分被洗脫出來(lái);以17 min為起點(diǎn)，每10 mL收集1個(gè)流分，至40 min時(shí)，流出液色譜圖中已無(wú)紫外吸收，停止收集。對(duì)已收集的各流分采用“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，通過(guò)與血根堿對(duì)照品溶液的保留時(shí)間比對(duì)可知，所有已收集流分中所含成分均為雜質(zhì)。然后將混合相中的B相體積比提高至50%[此時(shí)混合洗脫液組成為含20%甲醇、0.25 mol/L氯化鈉的20 mmol/L醋酸銨溶液（pH 5.5）]繼續(xù)進(jìn)行洗脫，至52 min時(shí)，洗脫液色譜圖中有明顯紫外吸收;此時(shí)起，保持上述洗脫條件，每10 mL收集1個(gè)流分，直至洗脫液無(wú)紫外吸收（見(jiàn)圖3）。對(duì)上述流分按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果第54～74 min期間洗脫物中成分為血根堿。合并這一時(shí)間段的洗脫液流分（即精提物溶液），用于進(jìn)一步脫鹽和精制純化。

2.3.6 博落回精提物溶液的精制純化 為除去精提物溶液中的醋酸銨、氯化鈉等無(wú)機(jī)鹽，將“2.3.4”項(xiàng)下得到的精提物溶液直接上樣至反相C18制備級(jí)色譜柱中，用2 BV的20%甲醇溶液以15 mL/min流速進(jìn)行脫鹽;然后以2 BV的甲醇同流速洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，得到橙紅色精制純化干燥粉末，純化收率為71%。經(jīng)HPLC法檢測(cè)，該精制純化物的純度為97%，并通過(guò)與血根堿對(duì)照品溶液的保留時(shí)間比對(duì)可初步判斷為血根堿。所得精制純化物的HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.4 博落回提取物精制純化物的結(jié)構(gòu)確證

取“2.3”項(xiàng)下制備的博落回精制純化物，經(jīng)HPLC法、紫外分光光度法、質(zhì)譜法（MS）和核磁共振氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）分別檢測(cè)。結(jié)果，該化合物與血根堿對(duì)照品保留時(shí)間一致，紫外特征吸收波長(zhǎng)分別為270、328、335（肩峰）、400、475 nm;電噴霧（ESI）-MS譜顯示，質(zhì)荷比（m/z）為332.5，與血根堿分子[C20H14NO4]+一致;1H-NMR譜（600 MHz，CD3OD）顯示，δ為9.90（1H，s，H-6）、8.57（1H，d，J=8.9 Hz，H-9）、8.48（1H，d，J=8.8 Hz，H-11）、8.17（1H，d，J=8.9 Hz，H-10）、8.11（1H，s，H-4）、7.93（1H，d，J=8.8 Hz，H-12）、7.52（1H，s，H-1）、6.53（2H，s，2，3-OCH2）、6.27（2H，s，7，8-OCH2）、4.93（3H，s，N-CH3）;13C-NMR譜（150 MHz，CD3OD）顯示，δ為150.68、150.60、150.50、149.27、147.97、133.91、132.65、128.81、127.30、121.66、121.00、119.38、118.07×2、111.00、106.79、106.35、104.79、104.14、52.64。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[18]比對(duì)，最終確認(rèn)博落回提取物的精制純化物為血根堿，相關(guān)譜圖詳見(jiàn)圖5。

3 討論

在已往相關(guān)研究中，對(duì)博落回生物堿的分離提取多針對(duì)的是生物總堿混合物[2-6]，而對(duì)于其單體生物堿的分離純化則鮮見(jiàn)報(bào)道。離子交換樹(shù)脂具有成本低、性能穩(wěn)定、分離速度快、環(huán)境污染少、可再生和反復(fù)使用的優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于化工生產(chǎn)、食品工業(yè)、制藥工業(yè)和環(huán)保等領(lǐng)域[17-18]。本研究首次采用以瓊脂糖為基質(zhì)的軟膠CM-FF型弱陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)博落回提取物進(jìn)行分離純化，并以反相C18制備柱進(jìn)行脫鹽及進(jìn)一步純化，最終得到純度為97%的血根堿產(chǎn)物，純化收率為71%。該工藝穩(wěn)定高效，為血根堿的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

陽(yáng)離子交換樹(shù)脂法利用生物堿陽(yáng)離子可被樹(shù)脂所吸附、中性或陰離子成分不被吸附的原理，常用來(lái)純化生物堿類(lèi)成分[19]。本研究首先通過(guò)靜態(tài)吸附與解吸附試驗(yàn)，對(duì)比了8種不同類(lèi)型離子交換樹(shù)脂及大孔樹(shù)脂對(duì)博落回提取物中血根堿的吸附和解吸附性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CM-FF、SP-HP型這兩種瓊脂糖基質(zhì)的軟膠陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的吸附和解吸附性能較佳。其原因可能為博落回提取物中所含有的血根堿及其類(lèi)似物（原阿片堿、別隱品堿、白屈菜紅堿等）均為苯并異喹啉類(lèi)衍生物且都具有很強(qiáng)的疏水性，在與另外6種基質(zhì)為聚苯乙烯的樹(shù)脂發(fā)生相互作用時(shí)，既有較強(qiáng)的π-π相互作用，又有電荷相互作用，從而使血根堿難以被解吸附并洗脫;而CM-FF、SP-HP型樹(shù)脂不會(huì)與血根堿及其類(lèi)似物發(fā)生疏水相互作用，而僅通過(guò)離子鍵相互作用，因此具備較好的解吸附性能[20-21]。同時(shí)，這類(lèi)樹(shù)脂基質(zhì)與博落回提取物間相互作用力弱，有利于樹(shù)脂的再生和循環(huán)利用，可有效延長(zhǎng)樹(shù)脂的使用壽命，從而降低工藝成本。而與SP-HP型強(qiáng)陽(yáng)離子樹(shù)脂比較，CM-FF型樹(shù)脂為弱陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，易于平衡，樹(shù)脂粒徑更大，反壓低，易于裝填，更利于工業(yè)化生產(chǎn)。

在篩選出CM-FF型弱陽(yáng)離子樹(shù)脂后，需要進(jìn)一步考察其工作參數(shù)?？紤]到弱陽(yáng)離子交換樹(shù)脂一般在pH4.5～6.5范圍內(nèi)性能較好，通過(guò)本研究考察，最終篩選出最佳上樣pH值為5.5。此外，本課題組前期通過(guò)對(duì)動(dòng)態(tài)流速和反壓進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，流速過(guò)低，則洗脫工藝時(shí)間將會(huì)延長(zhǎng)，不利于放大生產(chǎn);流速過(guò)高，在反壓較高的情況下，多批次使用后會(huì)造成樹(shù)脂床層的塌陷，從而導(dǎo)致柱效降低，無(wú)法完成分離純化。經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)考察，優(yōu)選出工作流速為5 mL/min，在此流速下，體系的反壓為1.5 bar（1 bar=100 kPa），在軟膠樹(shù)脂的最大耐壓3 bar范圍之內(nèi)。在溶劑選擇方面，由于博落回提取物疏水性較強(qiáng)，為保證樣品始終處于溶解狀態(tài)，本課題組在預(yù)試驗(yàn)中篩選了溶劑中甲醇的比例，結(jié)果顯示20%的甲醇比例為保持樣品完全溶解的最低甲醇用量。另外，在緩沖液體系的篩選中，考慮到20 mmol/L的醋酸銨體系具有良好的緩沖效果，最終優(yōu)選出含20%甲醇的20 mmol/L醋酸銨溶液為最佳離子交換洗脫體系。后期使用APPS 10D液相制備系統(tǒng)實(shí)時(shí)在線(xiàn)監(jiān)測(cè)進(jìn)行流分收集，再通過(guò)HPLC法監(jiān)測(cè)洗脫結(jié)果，最終確定了動(dòng)態(tài)洗脫工藝及流分收集體積。對(duì)于離子交換洗脫得到的精提物鹽溶液，再使用反相C18制備柱進(jìn)行脫鹽和精制純化，由圖3可見(jiàn)，精制純化物中的主要雜質(zhì)相對(duì)保留時(shí)間為1.79，表明其雜質(zhì)在反相體系中較易去除。

綜上所述，本研究采用離子交換工藝完成了博落回提取物中血根堿的分離純化，洗脫體系中有機(jī)溶劑的用量非常少，優(yōu)選工藝綠色環(huán)保、安全高效、易于操作，適合工業(yè)化生產(chǎn)。本研究所獲血根堿的純度為97%，今后有待進(jìn)一步優(yōu)化工藝提高精制品的純度;此外，由于軟膠樹(shù)脂耐壓性較差，工作流速相對(duì)較低，造成工藝耗時(shí)較長(zhǎng)，在今后的研究中將嘗試采用同類(lèi)型高交聯(lián)度且耐壓性更強(qiáng)的離子交換樹(shù)脂進(jìn)行分離純化。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 王朝元，童勝蘭，胡鑫.博落回生物堿成分及其抗菌活性的研究[J].中南民族大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，34（1）：39-42.

[ 2 ] 余坤，彭懿，卿志星，等.博落回根的化學(xué)成分研究[J].中藥材，2016，39（8）：1767-1770.

[ 3 ] 鄒惠亮，李紅玉，周光熊.博落回的生物堿成分及細(xì)胞毒活性研究[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40（3）：458-462.

[ 4 ] 楊鵬，卿志星，向峰.基于質(zhì)譜示蹤研究博落回根的化學(xué)成分[J].中藥材，2017，40（1）：84-86.

[ 5 ] OCH A，SZEWCZYK K，?UKASZ PECIO，et al. UPLC- MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papa- veraceae Families[J]. Oxid Med Cell Longev，2017. DOI：10.1155/2017/9369872.

[ 6 ] 葉馮芝，馮鋒，柳文媛.博落回的生物堿成分[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34（13）：1683-1686.

[ 7 ] 汪學(xué)軍，閔長(zhǎng)莉，韓彭壘.博落回不同部位提取物對(duì)大腸菌群的抑菌作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2016，28：247-250、288.

[ 8 ] 高紅梅，付小草，馬林.博落回生物堿對(duì)12種植物病原菌的生物活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（18）：5810-5812.

[ 9 ] 楊舒，劉巖，楊千帆，等.博落回抗腫瘤作用及誘導(dǎo)人體端粒DNA 形成G-四鏈體分子機(jī)制研究[J].中草藥，2011，42（4）：738-742.

[10] 田晶，郁建平，葛永輝.博落回中生物堿對(duì)五種皮癬真菌抑制作用的初步研究[J].中成藥，2010，32（7）：1108- 1110.

[11] 張素仙，王妍妍，張琴，等.血根堿對(duì)紫杉醇耐藥卵巢癌A2780/Taxol細(xì)胞生長(zhǎng)及TGF-β1/Smad通路抑制的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，38（6）：717-720.

[12] 張夢(mèng)雅，王春麗，杜先華，等.血根堿通過(guò)STAT3通路對(duì)LPS致RAW264.7細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2017，28（6）：714-718.

[13] HUANG P，XIA L，LIU W，et al. Hairy root induction and benzylisoquinoline alkaloid production in Macleaya cordata[J]. Sci Rep，2018，8（1）：11986.

[14] ESTRADA-ANGULO A，AGUILAR-HERNáNDEZ A，OSUNA-PéREZ M，et al. Influence of quaternary benzophenantridine and protopine alkaloids on growth performance，dietary energy，carcass traits，visceral mass，and rumen health in finishing ewes under conditions of severe temperature-humidity index[J]. Asian-Australas J Anim Sci，2016，29（5）：652-658.

[15] 鄭淑霞，易駿，吳巖斌，等.大孔樹(shù)脂純化蓮房總黃酮的工藝研究[J].中國(guó)藥房，2015，26（31）：4405-4408.

[16] 王忠震，林兵，宋洪濤，等.大孔吸附樹(shù)脂純化雷公藤4種有效成分的工藝研究[J].中國(guó)藥房，2016，27（16）：2261-2264.

[17] 于國(guó)慶.離子交換樹(shù)脂在天然產(chǎn)物分離純化中的應(yīng)用[J].天津化工，2012，26（5）：38-40.

[18] 袁帥，劉江云，周勝.博落回血根堿的制備工藝研究[D].蘇州：蘇州大學(xué)，2018.

[19] 張小艷，黃紅梅，汪尚坤，等.博落回的進(jìn)展研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（23）：157-162.

[20] 林曉彤，郭娜，周翎，等.草烏花總生物堿的純化工藝研究[J].中國(guó)藥房，2015，26（31）：4396-4398.

[21] 邱峰，呂華沖，馬驍馳.天然藥物化學(xué)[M].北京：清華大學(xué)出版社，2013：375-381.

（收稿日期：2019-03-15 修回日期：2019-07-04）

（編輯：段思怡）