馬秀梅 賀芷慧 田迷 汪喜衛(wèi) 羅迅 趙永清 李貞子

摘要：牦牛生活于青藏高原草甸、荒漠等地，能較好的適應(yīng)高海拔低氧環(huán)境。研究牦牛的高原低氧適應(yīng)性特征對于畜牧業(yè)的生產(chǎn)，預(yù)防并治療高原病有重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年，一些研究表明牦牛等高原世居動(dòng)物體內(nèi)存在著低氧適應(yīng)相關(guān)基因，并在機(jī)體低氧適應(yīng)的調(diào)控中起重要作用。該文就從一些低氧適應(yīng)性相關(guān)基因的調(diào)控探討牦牛適應(yīng)高海拔低氧環(huán)境的機(jī)理。

關(guān)鍵詞：牦牛;高海拔;低氧;適應(yīng)性;基因

中圖分類號：S823 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.18.002

0 引言

牦牛別名旄牛，屬于草食性反芻動(dòng)物，生活在海拔3000～5000m的青藏高原及比鄰地區(qū)，對高原特有的生態(tài)環(huán)境有極強(qiáng)的適應(yīng)性，因而被稱為“高原之舟”。對于藏族人來說，牦牛有非常重要的作用。在高原地區(qū)，只有它可以較好地利用高原牧草資源并發(fā)揮動(dòng)物性生產(chǎn)的主要作用。牦牛生存的地方熱輻射強(qiáng)，晝夜溫差大，氧分壓低，因此它對這種高原環(huán)境產(chǎn)生了自己的一套適應(yīng)機(jī)制。近年，許多研究學(xué)者已經(jīng)對牦牛適應(yīng)高原低氧環(huán)境的機(jī)制展開了大量實(shí)驗(yàn)探討，研究的主要是組織器官和分子機(jī)制。而有學(xué)者表示，高原哺乳動(dòng)物適應(yīng)低氧環(huán)境的機(jī)制主要是通過調(diào)控機(jī)體的細(xì)胞代謝以及相關(guān)的低氧適應(yīng)基因來發(fā)揮作用，而并非僅靠機(jī)體器官。近年，國內(nèi)外學(xué)者利用相關(guān)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了30余種低氧適應(yīng)的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)這些基因主要是通過控制機(jī)體紅細(xì)胞生成、調(diào)節(jié)糖代謝以及促使血管生長和收縮等途徑來增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體對氧氣的利用能力。因此該文從分子調(diào)控層面討論牦牛適應(yīng)高海拔低氧的適應(yīng)機(jī)制。

1 高原動(dòng)物對低氧適應(yīng)分子機(jī)制

1.1 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），是一種糖蛋白，也是在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生的主要作用因子。有關(guān)對牦牛肺血管內(nèi)皮因子的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF僅在肺泡壁有散在分布，正常氧濃度下VEGF表達(dá)量很低，起保持血管密度平衡的作用，缺氧時(shí)表達(dá)量會(huì)明顯升高，因?yàn)榈脱鯐r(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)通過分泌一些生長因子來控制平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖和成長，對牦牛的發(fā)育會(huì)產(chǎn)生影響，并使牦牛肺的結(jié)構(gòu)與低海拔地方的牛類有所不同，高原牦牛更能適應(yīng)低氧環(huán)境。對高原牦牛以及高原黃牛的不同組織研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子-A基因蛋白的序列在牦牛和黃牛之間是相同的，但該基因的表達(dá)在牦牛的肺和胰腺中較高。由此可得出結(jié)論低氧適應(yīng)可能與基因表達(dá)量有關(guān)，并且肺和脾是低氧適應(yīng)調(diào)節(jié)的重要部位。

1.2 內(nèi)皮PAS1蛋白（EPAS1）基因

內(nèi)皮PAS1蛋白（EPAS1）又稱缺氧誘導(dǎo)因子2（hypoxia induced factor-2，HIF-2），主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞中，是細(xì)胞缺氧時(shí)的主要轉(zhuǎn)錄因子。大多數(shù)由低氧導(dǎo)致的酶的變動(dòng)或因子均經(jīng)過EPAS1發(fā)揮作用。各個(gè)組織器官之間的氧氣交換都與血管和紅細(xì)胞有關(guān)，有研究對高原土著人進(jìn)行了全基因組等位基因分化掃描（GWADS），發(fā)現(xiàn)31個(gè)EPAS1 SNPs處于高度連鎖不平衡狀態(tài)，與血紅蛋白濃度顯著相關(guān)[1]。EPAS1是由HIF-2α和HIF-1β構(gòu)成的異二聚體復(fù)合物。常氧下HIF-2α與VHL泛素2蛋白酶復(fù)合體在羥化后的ODD作用下經(jīng)聯(lián)合，被泛素化，最后在蛋白水解酶作用下被降解，細(xì)胞內(nèi)的EPAS1含量較低，而缺氧情況下此降解途徑會(huì)被抑制。有研究在牦牛的EPAS1基因中檢測到3個(gè)SNPs均處于高度連鎖狀態(tài)，認(rèn)為EPAS1基因可作為耗牛適應(yīng)高原低氧環(huán)境的分子信號。

1.3 促紅細(xì)胞生成素（EPO）基因

促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是主要由腎臟合成的特異性糖蛋白激素。其可以結(jié)合紅細(xì)胞表面的EPO受體，在機(jī)體供氧不足情況下，EPO基因的mRNA表達(dá)水平顯著增加，紅細(xì)胞數(shù)也會(huì)增多。在骨髓造血微環(huán)境下，EPO基因促使紅細(xì)胞的生成與分化。EPO調(diào)控紅細(xì)胞數(shù)的主要作用因子是由低氧誘導(dǎo)生成的，而基因的3’非編碼區(qū)包括低氧誘導(dǎo)因子的應(yīng)答元件。

高海拔和低海拔地區(qū)的牦牛與平原地區(qū)的黃牛相比，高海拔地區(qū)牦牛血液中低氧因子EPO含量相對較高[2]。用PCR-SSCP技術(shù)對牦牛促紅細(xì)胞生成素（EPO）基因進(jìn)行了多態(tài)性分析檢測，發(fā)現(xiàn)了EPO基因中的AA，AB和BB3種基因型，會(huì)隨海拔的不同表現(xiàn)出差異。海拔升高，A等位基因頻率也升高，BB型的頻率則下降，而且群體雜合度和多態(tài)信息含量也會(huì)逐步下降，認(rèn)為這種差異與牦牛對低氧產(chǎn)生適應(yīng)性特征可能有關(guān)系[3]。

1.4 低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）基因

低氧誘導(dǎo)因子1（Hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1）是參與缺氧適應(yīng)性反應(yīng)中主要的蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，見表1[4]，具有DNA結(jié)合活性。

HIF-1是HIF-α和HIF-β2種亞基構(gòu)成的異二聚體復(fù)合物，主要作用是調(diào)控組織和器官中氧的動(dòng)態(tài)平衡。其中HIF-1α亞基包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α3種類型，這三者都受氧濃度影響，并且是調(diào)控HIF活性的功能性亞單位。而HIF-1β作為HIF的結(jié)構(gòu)性亞基并不受氧濃度的影響。α和β亞基，都由bHLH（basichelix-loop-helix）、PAS（Per/Arnt/Sim）、ODD（oxygen-dependentdegradtion）和TAD（transactiva-tion domain）這4種結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。許多研究表示HIF-1是平衡氧穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)低氧反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)節(jié)模式見圖2[5]。

注：VHL：腫瘤抑制蛋白，ODD：氧降解域，TAD：HIF-1α抑制性結(jié)構(gòu)域，PHD：脯氨酸羥化酶，P300/CBP：共激活因子，F(xiàn)IH：HIF-1抑制因子，HREs：低氧應(yīng)答元件，Proteasome：蛋白酶體。

在常氧下，PHD會(huì)催化HIF-1α的氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域（ODD）中特定的脯氨酞?dú)埢腇e（Ⅱ）依賴性，使其羥基化，進(jìn)而HIF-1α亞基迅速結(jié)合VHL，VHL會(huì)靶向HIF-1α進(jìn)行多泛素化并使其降解。HIF-1抑制因子（FIH）在常氧下會(huì)結(jié)合HIF-1α抑制性結(jié)構(gòu)域（TAD）使其羥基化，抑制HIF-1α聯(lián)合P300/CBP，從而限制HIF轉(zhuǎn)錄活性;而在缺氧條件下，PHD沒有使HIF-1α羥基化的作用，HIF-1α?xí)Y(jié)合P300/CBP，并與HIF-β形成二聚體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中作用于HREs，啟動(dòng)缺氧轉(zhuǎn)錄程序，激活多種下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)的缺氧調(diào)節(jié)元件，引發(fā)組織細(xì)胞一系列低氧適應(yīng)性反應(yīng)。因此氧誘導(dǎo)因子是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，在所有后生動(dòng)物體內(nèi)都起著調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的主要作用。在常氧條件下，處于和成與降解過程，只有缺氧條件下才穩(wěn)定表達(dá)。對青海牦牛HIF-1α基因的組織表達(dá)進(jìn)行相關(guān)檢測[6]，發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因在心、肝、肺、脾、腎、腦、肌肉、睪丸組織中均有表達(dá)，其中睪丸和脾中的表達(dá)量最高，肌肉中的表達(dá)量最低，此研究表明了HIF-1α在高原世居動(dòng)物低氧適應(yīng)的分子機(jī)制中有著重要的意義。

1.5 線粒體基因

線粒體作為一種半自主細(xì)胞器，本身具有遺傳物質(zhì)和遺傳體系，它是生物體的能量來源，可以調(diào)控細(xì)胞的成長和細(xì)胞周期。線粒體內(nèi)膜上含有參與各種氧化反應(yīng)的酶類及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在低氧適應(yīng)的途徑中起重要作用。線粒體基因組包括編碼有些rRNA、tRNA基因以及13個(gè)編碼蛋白質(zhì)的功能基因。這些基因的突變以及表達(dá)量變化會(huì)使細(xì)胞呼吸鏈效率發(fā)生變化，進(jìn)而參與到機(jī)體低氧適應(yīng)途徑中[7]。線粒體對缺氧反應(yīng)很敏感，高原動(dòng)物在缺氧情況下細(xì)胞中的線粒體會(huì)消耗并且電子傳遞鏈復(fù)合物降低，產(chǎn)生許多活性氧（reactive oxygen species，ROS）。而線粒體會(huì)通過自噬的方式減少ROS對細(xì)胞及機(jī)體正常代謝的影響，使生物適應(yīng)高原低氧環(huán)境。

1.6 血紅蛋白（H6）基因

血紅蛋白是紅細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸氧的蛋白質(zhì)，在高氧分壓下結(jié)合氧，低氧分壓下解離氧，為動(dòng)物機(jī)體供應(yīng)能量代謝所需的氧，血紅蛋白與氧結(jié)合特點(diǎn)對動(dòng)物抵抗低氧的能力起重要的生理作用。高原世居動(dòng)物是以改變細(xì)胞內(nèi)Hb結(jié)構(gòu)與功能來提高對氧的親和力。據(jù)研究測定，海拔4300m左右的青?，敹嚓笈５难t蛋白顯著高于海拔3000m左右的西藏林芝地區(qū)的牦牛[8]。這表明海拔越高血液中的HB含量越多，進(jìn)而使牦牛血液中氧容量增多，在正常呼吸情況下運(yùn)輸更多的氧來適應(yīng)低氧環(huán)境。

1.7 肌紅蛋白（Mb）基因

肌紅蛋白（Myoglobin，Mb）主要存在于哺乳動(dòng)物肌細(xì)胞中，是儲(chǔ)存和調(diào)配氧的蛋白質(zhì)。它由一條多肽鏈和一個(gè)輔基血紅素組成，在缺氧條件下機(jī)體會(huì)通過增加Mb含量來適應(yīng)低氧環(huán)境。檢測高海拔地區(qū)動(dòng)物心肌細(xì)胞的Mb發(fā)現(xiàn)其含量明顯升高，這有利于氧的運(yùn)輸。據(jù)研究表明青?，敹啵?300m左右）牦牛的心肌和骨骼肌的Mb含量均高于青海循化（3500m左右）牦牛。

1.8 EGLN1基因

EGLN1（Egl nine homolog 1）又稱脯氨酰羥化酶2蛋白（Prolyl hydroxylase domain protein 2，PHD2），是PHD家族成員中的一種（PHD有四種，分別是PHD1，PHD2，PHD3和PHD4，前三種為關(guān)注熱點(diǎn)）。EGLN1基因是重要的氧傳感基因，也是HIF-1α信號通路的重要調(diào)控基因。有研究用生物信息學(xué)方法對哺乳動(dòng)物EGLN1基因的適應(yīng)性進(jìn)化進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示EGLN1基因中檢測到正選擇位點(diǎn)，從而推斷出在進(jìn)化中EGLN1基因受到正選擇作用，形成適應(yīng)性進(jìn)化（如低氧環(huán)境的適應(yīng)性等）[9]檢測牦牛和黃牛心臟、肺臟、肝臟及大腦等器官中的EGLN1基因后，發(fā)現(xiàn)牦牛各器官中的EGLN1基因表達(dá)量均高于黃牛，且肝臟中的表達(dá)量最高[10]。這也可以說明EGLN1基因可作為研究低氧適應(yīng)性的重要基因之一。

1.9 其他重要基因

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）基因是一類使機(jī)體或細(xì)胞免受損害的熱應(yīng)激蛋白質(zhì)。在高原缺氧情況下HSP70會(huì)減弱細(xì)胞的下一次受損程度，維持細(xì)胞的正常生理機(jī)能。羥甲基膽素合酶（HMBS）基因，是編碼一系列羥甲基膽素合酶超家族中的一個(gè)成員。它編碼的蛋白質(zhì)屬于細(xì)胞血紅素生物合成途徑的第三種酶，而血紅素是肌紅蛋白和血紅蛋白等的輔基。由此可認(rèn)為HMBS基因的蛋白質(zhì)在參與細(xì)胞血紅素生物合成途徑中也與低氧適應(yīng)性有關(guān)。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）基因，是一種擁有細(xì)胞解毒作用的蛋白質(zhì)，主要分布在于細(xì)胞質(zhì)中。GST是體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的首要組成部分，在抗癌、解毒、保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受氧化損害中起重要作用。由于長期生活在高海拔地區(qū)容易使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生對細(xì)胞有損害的活性氧（ROS），而GST是可以清除活性氧的關(guān)鍵酶之一。

2 結(jié)論

低氧適應(yīng)是機(jī)體在高原低氧，或者是在特殊情況下為維持機(jī)體正常功能，所產(chǎn)生的一種特殊的保護(hù)機(jī)制，其中低氧適應(yīng)基因起主要調(diào)節(jié)作用。低氧適應(yīng)基因是指在缺氧條件下能誘導(dǎo)低氧適應(yīng)反應(yīng)機(jī)制的基因群，這些基因可以調(diào)節(jié)紅細(xì)胞形成，血管生長，糖代謝和應(yīng)激反應(yīng)等生理性功能，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體氧的攝取量和利用率。綜合上述多個(gè)基因?qū)Φ脱踹m應(yīng)性調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，無論是在細(xì)胞還是在機(jī)體的局部水平，HIF-1都是缺氧信號傳遞的重要樞紐，而HIF-1α被認(rèn)為是細(xì)胞缺氧感應(yīng)所必需的核心轉(zhuǎn)錄因子。高原動(dòng)物對低氧環(huán)境在分子層面上做出的適應(yīng)性和調(diào)控是極其復(fù)雜多樣的，機(jī)體對低氧基因表達(dá)的調(diào)控有待做深入研究。

3 結(jié)束語

長期生活在高海拔地域的動(dòng)物對低氧環(huán)境已經(jīng)具有良好的遺傳適應(yīng)性。對高原動(dòng)物如藏豬、藏獒、藏雞、耗牛及一些飛禽魚類等典型的耐低氧動(dòng)物，展開低氧適應(yīng)研究，并探討搜集低氧適應(yīng)性基因，對于一些高原病的預(yù)防和診治，保存高原動(dòng)物特色優(yōu)良基因，培育高產(chǎn)耐低氧的畜禽品種有著重要的意義，同時(shí)也對人類及動(dòng)物對低氧環(huán)境的征服做出貢獻(xiàn)。而目前關(guān)于高原低氧適應(yīng)性的分子機(jī)制研究較少，處于發(fā)展水平，對很多機(jī)體的缺氧感受傳導(dǎo)途徑還不是很清楚。研究牦牛等高原世居動(dòng)物的低氧適應(yīng)性分子機(jī)制與生理機(jī)理，應(yīng)從細(xì)胞、分子、代謝和基因組學(xué)等各方面進(jìn)行深入、全面的整合分析，擴(kuò)大基因組學(xué)的研究范圍，以期闡明其低氧適應(yīng)在轉(zhuǎn)錄組、基因組及蛋白組綜合分析研究中的詳細(xì)機(jī)制。

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基金項(xiàng)目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù).牦牛代謝特征及HIF對代謝調(diào)控關(guān)鍵酶影響的研究（項(xiàng)目編號：31920180131）;西北民族大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：201910742095）

作者簡介：馬秀梅（1999-），女，東鄉(xiāng)族，甘肅康樂人，動(dòng)物科學(xué)專業(yè)。

通信作者：趙永清（1979-），男，回族，甘肅天水人，博士，副教授，研究方向：動(dòng)物低氧下的基因調(diào)控。

李貞子（1984-），女，畬族，浙江溫州人，碩士，高級實(shí)驗(yàn)師，研究方向：畜產(chǎn)品加工。