莫芳芳 劉海霞 華靜 趙丹丹 高思華

摘要? 目的：通過研究降糖消渴顆粒含藥血清對(duì)INS-1細(xì)胞PI3K/AKT/FOXO1通路中相關(guān)蛋白與基因表達(dá)的影響，探討降糖消渴顆粒含藥血清保護(hù)胰島B細(xì)胞的分子機(jī)制。方法：選取FOXO1高表達(dá)INS-1穩(wěn)定細(xì)胞株，分別以1%、5%、10%、15%、20%不同濃度降糖消渴顆粒含藥血清干預(yù)，用MTT法計(jì)算細(xì)胞成活率以觀察藥物毒性，分別檢測(cè)各組細(xì)胞中總FOXO1蛋白水平以確定最佳藥物濃度開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞用或不用PI3K抑制劑LY294002干預(yù)后，以Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中總FOXO1、p-FOXO1、Akt、p-Akt和細(xì)胞核內(nèi)外的FOXO1、p-FOXO1的蛋白表達(dá)，qRT-PCR檢測(cè)FOXO1mRNA和AktmRNA含量。結(jié)果：不同濃度含藥血清對(duì)細(xì)胞均無毒性，其中10%為最佳藥物干預(yù)濃度。10%含藥血清使磷酸化FOXO1和Akt的表達(dá)升高;在胞質(zhì)和胞核中，10%含藥血清使FOXO1的表達(dá)降低，磷酸化表達(dá)升高，抑制劑LY294002使FOXO1和p-FOXO1表達(dá)均降低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）結(jié)果顯示，Akt mRNA表達(dá)升高，F(xiàn)OXO1mRNA表達(dá)降低，抑制劑使FOXO1mRNA表達(dá)降低，結(jié)果與Western blotting結(jié)果一致。結(jié)論：降糖消渴顆粒含藥血清可通過PI3K/AKT/FOXO1通路促進(jìn)FOXO1磷酸化出核以抑制FOXO核轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)保護(hù)胰島B細(xì)胞的作用。

關(guān)鍵詞? 肝脾腎同調(diào);降糖消渴顆粒;PI3K/AKT/FOXO1通路;FOXO1因子;胰腺;INS-1細(xì)胞;2型糖尿病;含藥血清

Effects of Jiangtang Xiaoke Granules Containing Serum on Phosphoinositide-3 Kinase/AKT/FOXO1 Signaling Pathway in INS-1 Cells

Mo Fangfang1， Liu Haixia1， Hua Jing2， Zhao Dandan1， Gao Sihua1

（1 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 2 Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract Objective： To study the effects of Jiangtang Xiaoke Granules containing serum on expressions of protein and genes of phosphoinositide-3 kinase （PI3K）/AKT/FOXO1 signaling pathway in INS-1 cells to explore the molecular mechanism of serum contained Jiangtang Xiaoke Granules on protecting β-cells.? Methods： The FOXO1 high expression INS-1 stable cell line was selected and treated with 1%， 5%， 10%， 15% and 20% different concentrations of Jiangtang Xiaoke Granules containing serum. The cell survival rate was calculated by MTT method to observe the toxicity of the drug. The total FOXO1 protein level in each group was detected to determine the optimal drug concentration for subsequent experiments. The cells were transfected with or without the PI3K inhibitor LY294002. Western blotting was used to detect the expression of FOXO1， p-FOXO1， Akt， p-Akt and FOXO1 and p-FOXO1 in the nucleus. The expression of FOXO1 mRNA and Akt mRNA was detected by qRT-PCR.? Results： Different concentrations of drug-containing serum were not toxic to cells， and 10% of them were the optimal drug intervention concentration. The expression of phosphorylated FOXO1 and Akt was increased with 10% drug-containing serum. In the cytoplasm and nucleus， the expression of FOXO1 was decreased and the expression of phosphorylation was increased with 10% drug-containing serum， and the expression of FOXO1 and p-FOXO1 were decreased by the inhibitor LY294002. The results of real-time quantitative PCR （qRT-PCR） showed that the expression of Akt mRNA was increased， the expression of FOXO1 mRNA was decreased， and the expression of FOXO1 mRNA was decreased by inhibitor. The results were consistent with the results of Western blotting.? Conclusion： The drug-containing serum of Jiangtang Xiaoke Granules can promote the phosphorylation of FOXO1 through the PI3K/AKT/FOXO1 pathway to inhibit the transcription of FOXO nuclear to protect islet B cells.

Key Words? Common regulation of liver， spleen and kidney; Jiangtang Xiaoke Granules， PI3K/AKT/FOXO1 signaling pathway; FOXO1; pancreas; INS-1 cells; Type 2 diabetes mellitus; Serum containing drug

中圖分類號(hào)：R242;R587.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.020

2型糖尿?。―iabetes Mellitus，Type 2， T2DM）是一種以胰島素分泌不足和胰島素抵抗為基本特征的慢性糖脂代謝紊亂性疾病[1-2]。眾所周知，胰島素抵抗是T2DM的最主要病理機(jī)制，然而胰島細(xì)胞功能受損導(dǎo)致胰島素分泌不足在T2DM病理中的作用也越來越受到重視。近年有研究表明胰島B細(xì)胞功能受損可導(dǎo)致胰島素分泌不足還會(huì)降低各組織對(duì)胰島素的敏感性，進(jìn)一步影響胰島素抵抗[3-4]。因此，恢復(fù)胰島B細(xì)胞功能應(yīng)是T2DM治療的重要方面。

導(dǎo)師高思華教授在多年臨證經(jīng)驗(yàn)中總結(jié)出肝脾腎同調(diào)治療T2DM，而降糖消渴顆粒正是在此理論指導(dǎo)下所形成的方劑，目前已經(jīng)取得了比較滿意的臨床療效[5]。此外，在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，降糖消渴顆粒含藥血清能夠很好的改善INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能，促進(jìn)細(xì)胞中FOXO1磷酸化水平[6]。本研究繼續(xù)以降糖消渴顆粒含藥血清干預(yù)INS-1細(xì)胞，探討降糖消渴顆粒對(duì)PI3K/AKT/FOXO1通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

選取SD大鼠20只，雄性，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，平均體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001）。INS-1大鼠胰島瘤細(xì)胞株購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 藥物

由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥科技發(fā)展部生產(chǎn)降糖消渴顆粒的成藥顆粒劑型，經(jīng)質(zhì)量鑒定，顆粒含5.01 g/kg生藥，在北京中醫(yī)藥大學(xué)糖尿病研究中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存藥物樣品（4 ℃保存），以備參考。實(shí)驗(yàn)臨用時(shí)，將顆?；烊胝麴s水中配制成所需濃度的混懸液[7]。

1.1.3 試劑與儀器

電泳和轉(zhuǎn)膜裝置、XRS凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo公司）。FG，POWER SYBR GREEN PCR（INVITROGEN）;胎牛血清（EVERY GREEN）;β-巰基乙醇（Genview）;四環(huán)素Doxycycline（Genechem）;LY294002抑制劑（Selleck）;RNeasy Mini Kit（QIAGEN）;青/鏈霉素（HYCLONE）;胰蛋白酶（SOLARBIO）;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（FERMENTAS）;AKT抗體、FOXO1抗體和磷酸化Akt（Thr308）抗體（CST）;磷酸化FOXO1 A（Ser-256）（Abcam）;RPMI-1640培養(yǎng)基、PCR引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

設(shè)正常組、模型組、降糖消渴顆粒含藥血清組（1%、5%、10%、15%、20%）和LY294002組。按體質(zhì)量隨機(jī)分組：對(duì)照組10只，降糖消渴顆粒組10只，降糖消渴顆粒大鼠給藥劑量是臨床人公斤體質(zhì)量用量的60倍，約每天52.8 g生藥/（kg·體質(zhì)量）。每天早晚灌胃各1次，共7 d。對(duì)照組灌胃等量蒸餾水。末次灌胃后1 h，處死大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，4 ℃靜置1 h，3 000 r/min離心20 min，分離含藥血清，56 ℃水浴30 min滅活，微孔濾膜過濾除菌，凍存管分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆肹8]。

大鼠胰島瘤細(xì)胞株INS-1培養(yǎng)及模型制備：RPMI-1640培養(yǎng)基加入10%胎牛血清（FBS），100 IU/mL青鏈霉素，50 μmol/Lβ-巰基乙醇在37 ℃，5%CO2條件下無菌培養(yǎng)INS-1細(xì)胞，每24 h更換培養(yǎng)基1次，待細(xì)胞密度達(dá)到70% ～80%后細(xì)胞傳代凍存。細(xì)胞傳代2次后，細(xì)胞密度再次達(dá)到80%時(shí)應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法將含有FOXO1基因片段的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入INS-1細(xì)胞，經(jīng)puromycin篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)FOXO1細(xì)胞株（OE）和陰性對(duì)照細(xì)胞株（NC），2.5 μg/mL Doxycycline干預(yù)12 h誘導(dǎo)FOXO1表達(dá)。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)NC、OE 2種細(xì)胞株中FOXO1基因的表達(dá)情況。OE組FOXO1基因的表達(dá)豐度是NC組的2倍以上說明FOXO1基因轉(zhuǎn)染成功，得到FOXO1高表達(dá)INS-1細(xì)胞模型[6]。

分別用20%、15%、10%、5%、1%含藥血清干預(yù)正常INS-1細(xì)胞與FOXO1高表達(dá)模型細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立正常INS-1細(xì)胞對(duì)照組與FOXO1高表達(dá)模型細(xì)胞對(duì)照組。

用和不用Dox誘導(dǎo)OE細(xì)胞株得到FOXO1高表達(dá)模型細(xì)胞和正常對(duì)照細(xì)胞，再用不同濃度的含藥血清（20%、15%、10%、5%和1%）處理模型細(xì)胞24 h，提取總蛋白，檢測(cè)FOXO1蛋白的表達(dá)。

用或不用Dox誘導(dǎo)FOXO1高表達(dá)模型細(xì)胞，以10%FBS做對(duì)照，加或不加25 μmol/L PI3K抑制劑LY294002和10%含藥血清干預(yù)24 h。

1.2.2 給藥方法

將正常INS-1細(xì)胞和FOXO1高表達(dá)模型細(xì)胞分別以104密度種于24孔板培養(yǎng)12 h，再分別以不同濃度含藥血清干預(yù)24 h，經(jīng)指標(biāo)檢測(cè)篩選最佳給藥濃度后，含藥血清組加或不加25 μmol/L PI3K通路抑制劑LY294002培養(yǎng)24 h。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)與方法

1）MTT檢測(cè)：將INS-1細(xì)胞和FOXO1高表達(dá)模型細(xì)胞種于96孔板，每孔4 000個(gè)，12 h后，分別用20%、15%、10%、5%、1%含藥血清培養(yǎng)24 h，棄去液體，每孔加入90 μL的培養(yǎng)基和10 μL 5 mg/mL的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去液體，加100 μL的DMSO溶解結(jié)晶，在570 nm測(cè)定吸光度。

2）Western blotting檢測(cè)：應(yīng)用蛋白裂解液與核質(zhì)蛋白分離提取試劑盒（Beyotime）分別提取細(xì)胞總蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白和核蛋白。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。以裂解液調(diào)整蛋白濃度至相同水平，按1∶ 1加入2X上樣緩沖液稀釋，沸水煮5 min。制備凝膠上樣，每個(gè)樣品加入30 μL，總蛋白量30 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜。將聚偏二氟乙烯膜（PVDF取出，使用適量TBST溶液清洗。加入封閉液，室溫下，置于搖床上緩慢搖動(dòng)2 h。移除封閉液，加入以封閉液稀釋的Ⅰ抗（Akt、phospho-Akt（Thr308）、FOXO1、phospho-FOXO1（Ser256）和β-actin稀釋比例1∶ 1 000）。在4 ℃條件下，置于搖床上，以適當(dāng)速率孵育過夜。結(jié)束后室溫條件下TBST溶液洗滌3次，10 min/次，再以TBST溶液按1∶ 5 000稀釋Ⅱ抗，室溫下孵育1 h，結(jié)束后以TBST溶液清洗PVDF3次。按ECL試剎盒說明書配置ECL顯色液，凝膠成像儀曝光成像，分析條帶灰度并定量分析。

3）qRT-PCR檢測(cè)：收集細(xì)胞，加入TRIzol提取總RNA。應(yīng)用Nano Drop2000超微量紫外分光光度計(jì)，選擇核酸（RNA）模式。校對(duì)后，依次檢測(cè)各樣品1 μL。通過A230、A260和A280值，對(duì)RNA純度、濃度進(jìn)行檢測(cè)。將0.1 μg總RNA加入離心管，70 ℃條件下溫育10 min，短暫離心后置于冰上保存。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書建立10 μL反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄條件如下：42 ℃，15 min;95 ℃，5 min，4 ℃，5 min，-20 ℃保存。取上述反應(yīng)液2 μL，2×SYBR Green mixture 5 μL;Forward primer 10 μmol/L，1 μL;Reverse primer 10 μmol/L，1 μL;Template DNA 1 μL;Rnase Free water 2 μL;反應(yīng)總體積為10 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s;60 ℃ 30 s;40 cycles。引物序列見表1。釆用溶解曲線分析方法，以Ct值為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)公式計(jì)算各基因起始模版濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，多組比較用單因素方差分析，進(jìn)而用最小顯著差異法進(jìn)行兩兩比較，以 P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 含藥血清細(xì)胞毒性觀察

24 h1%、5%、10%、15%、20%含藥血清對(duì)INS-1正常細(xì)胞和FOXO1高表達(dá)INS-1模型細(xì)胞均無影響，提示含藥血清對(duì)細(xì)胞無毒性。見表2。

2.2 不同濃度含藥血清對(duì)FOXO1表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，其他組FOXO1蛋白相對(duì)表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。與模型空白對(duì)照組比較，含藥血清各組FOXO1蛋白相對(duì)表達(dá)有增加或減少趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05），其中10%含藥血清干預(yù)模型細(xì)胞所得FOXO1相對(duì)表達(dá)量減少趨勢(shì)最明顯，故選10%含藥血清做后續(xù)通路實(shí)驗(yàn)。見圖1。

2.3 含藥血清對(duì)PI3K/AKT/FOXO1通路中相關(guān)蛋白及其磷酸化表達(dá)的影響

圖2A是細(xì)胞中總FOXO1、p-FOXO1、Akt和p-Akt的蛋白表達(dá)條帶，圖2B是細(xì)胞核中FOXO1、p-FOXO1蛋白表達(dá)條帶，圖2C是細(xì)胞質(zhì)中FOXO1、p-FOXO1蛋白表達(dá)條帶?？偟鞍字校現(xiàn)OXO1經(jīng)Dox干預(yù)表達(dá)升高，含藥血清對(duì)其表達(dá)影響較小，加入抑制劑使FOXO1表達(dá)降低，p-FOXO1經(jīng)Dox干預(yù)表達(dá)降低，含藥血清使其表達(dá)升高，抑制劑也會(huì)抑制p-FOXO1表達(dá)。Akt的表達(dá)沒有發(fā)生變化，而p-Akt經(jīng)Dox干預(yù)表達(dá)降低，含藥血清促使其表達(dá)升高，抑制劑抑制p-Akt的表達(dá)。在胞核和胞質(zhì)中，Dox干預(yù)使FOXO1表達(dá)升高，p-FOXO1表達(dá)降低，抑制劑使FOXO1和p-FOXO1表達(dá)均降低，含藥血清使FOXO1表達(dá)降低，p-FOXO1表達(dá)升高。

2.4 含藥血清對(duì)PI3K/AKT/FOXO1通路中相關(guān)基因表達(dá)的影響

Akt基因的相對(duì)表達(dá)在模型組和LY294002抑制劑組中減少，10%含藥血清促進(jìn)Akt的表達(dá);FOXO1基因的相對(duì)表達(dá)被LY294002抑制劑和10%含藥血清抑制，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。見圖3。

3 討論

FoxO是Fox（Forkhead）的一個(gè)亞族，對(duì)于細(xì)胞分化、凋亡，動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝以及炎性反應(yīng)和免疫等方面有調(diào)控作用[9]。FOXO1（Forkhead box O1）又屬于FOXO亞家族中的一員。已有研究表明，胰島B細(xì)胞FOXO1的表達(dá)很豐富[10]。在高血糖發(fā)生和胰島B細(xì)胞線粒體代謝障礙過程中FOXO1信號(hào)傳導(dǎo)是中心環(huán)節(jié)之一[11-12]，經(jīng)由PI3K/AKT/FOXO1途徑而影響B(tài)細(xì)胞應(yīng)激、增殖、凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[13-14]。

在胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（INS/IGF-1）信號(hào)通路中，F(xiàn)OXO1是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子之一，受磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/PKB）磷酸化級(jí)聯(lián)通路的調(diào)節(jié)。當(dāng)PI3K/AKT途徑被激活后，F(xiàn)OXO1中3個(gè)保守的AKT/PKB蛋白激酶位點(diǎn)被磷酸化，迫使FOXO1發(fā)生核輸出，進(jìn)而失去轉(zhuǎn)錄活性。相反，當(dāng)胰島素信號(hào)減弱時(shí)，通過PI3K/AKT通路，AKT/PKB蛋白激酶活性降低，使FOXO1磷酸化水平降低，滯留在細(xì)胞核內(nèi)，通過誘導(dǎo)靶基因表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞功能的改變[15]?？梢?，F(xiàn)OXO1的活性受胰島素的負(fù)調(diào)節(jié)。

我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)降糖消渴顆粒含藥血清干預(yù)后，F(xiàn)OXO1高表達(dá)INS-1細(xì)胞中，葡萄糖消耗量和胰島素分泌量均有所增加。但經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示FOXO1總蛋白量和mRNA水平均無顯著變化，而FOXO1蛋白的磷酸化水平卻升高明顯。這說明降糖消渴顆粒含藥血清促進(jìn)了FOXO1高表達(dá)INS-1細(xì)胞中FOXO1的磷酸化，造成FOXO1核輸出，降低了其轉(zhuǎn)錄活性。而這很可能是通過激活了PI3K/AKT途徑，達(dá)到保護(hù)胰島B細(xì)胞的作用[12]?；诖?，我們?yōu)檫M(jìn)一步證實(shí)降糖消渴顆粒是否通過激活PI3K/AKT/FOXO1信號(hào)通路而發(fā)揮作用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞用或不用PI3K抑制劑LY294002干預(yù)后細(xì)胞中總FOXO1、p-FOXO1、Akt、p-Akt和細(xì)胞核內(nèi)外的FOXO1、p-FOXO1的蛋白表達(dá)以及FOXO1、Akt的mRNA含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明在總蛋白中，含藥血清對(duì)FOXO1和Akt表達(dá)影響較少，而磷酸化的表達(dá)升高;在胞質(zhì)和胞核中，含藥血清使FOXO1的表達(dá)降低，磷酸化表達(dá)升高，抑制劑LY294002使FOXO1和p-FOXO1表達(dá)均降低。在基因檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)含藥血清使Akt表達(dá)升高，F(xiàn)OXO1表達(dá)降低，抑制劑使FOXO1表達(dá)降低，結(jié)果與Western blotting結(jié)果相似。這提示降糖消渴顆粒含藥血清可通過PI3K/AKT/FOXO1通路促進(jìn)FOXO1磷酸化出核以抑制FOXO1核轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)保護(hù)胰島B細(xì)胞的作用。

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