朱星宇 周燕萍 陸金蘭 林上陽 謝輝 夏晨潔 李偉

摘要? 目的：建立杜仲不同炮制品（生品、鹽品與炭品）的水提液指紋圖譜，從整體水平表征杜仲炮制前后的化學(xué)成分變化，為杜仲質(zhì)量控制提供參考。方法：采用HPLC法，Kromasil 100-5-C18色譜柱，0.3%磷酸水溶液-乙腈為流動相，梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長為238 nm。建立10批杜仲不同炮制品水提液的指紋圖譜，利用中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012A版）計(jì)算相似度，同時(shí)運(yùn)用聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA）對杜仲炮制前后進(jìn)行模式識別分析。結(jié)果：建立了杜仲不同炮制品的水提液指紋圖譜，生品標(biāo)定了7個(gè)共有峰，鹽品標(biāo)定了7個(gè)共有峰，炭品標(biāo)定了8個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中5個(gè)共有峰。HCA和PCA模式識別能夠明顯區(qū)分杜仲不同炮制品。結(jié)論：HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別能夠有效地區(qū)分杜仲不同炮制品，為其質(zhì)量控制研究提供參考。

關(guān)鍵詞? 杜仲;炮制品;HPLC指紋圖譜;化學(xué)模式識別;水提液;聚類分析;成分分析

Comparative Study on Fingerprints of Decoctions of Processed Products of Eucommiae Cortex

Zhu Xingyu1，2，3，Zhou Yanping2，3，Lu Jinglan2，3，Lin Shangyang2，3，Xie Hui2，3，Xia Chenjie2，3，Li Weidong2，3

（1 Jiangsu College of Nursing，Huaian，223001，China; 2 Engineering Center of State Ministry of Education for Standardization of Chinese Medicine Processing，Nanjing 210023，China; 3 Key Laboratory of State Administration of TCM for Standardization of Chinese Medicine Processing，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Abstract Objective： To establish the fingerprints of water extracts from different processed products （raw，salt and charcoal） of Eucommiae Cortex to characterize the changes of chemical components before and after processing at the overall level，and to provide reference for the quality control of Eucommiae Cortex. Methods： HPLC method was applied，and Kromasil 100-5-C18 column was used with 0.3% phosphoric acid in water （v/v）-acetonitrile as the elution system in gradient elution mode.The flow rate was 1.0 mL/min and the detective wavelength was 238 nm.Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 A edition） was used to establish fingerprints of 10 batches of different processed Eucommiae Cortex products.Meanwhile，Hierarchical Cluster Analysis （HCA） and Principal Component Analysis （PCA） as methods of pattern recognition were applied to give an overall evaluation. Results： The common modes of HPLC fingerprint for different processed Eucommiae Cortex were set up.There were 7 common peaks in crude and salt products，respectively，and 8 common peaks for the charcoal products. Conclusion： The combination of fingerprints and chemical pattern recognition was an effective method for the distinction between different processed Eucommiae Cortex.The results would provide meaning references for quality evaluation of Eucommiae Cortex.

Key Words? Eucommiae Cortex; Processed products; Fingerprint; Chemical pattern recognition; Water extract; Cluster analysis; Component analysis

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ?doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.004

杜仲為杜仲科植物杜仲 （Eucommia u1moides? Oliv.）的干燥樹皮，性甘，溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，安胎的功效。用于肝腎不足，腰膝酸痛，筋骨無力，頭暈?zāi)垦?，妊娠漏血，胎動不安[1]?，F(xiàn)代研究表明，杜仲中主要含有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類、萜類、多糖類等化學(xué)成分，主要具有降壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗炎、保肝利膽、抗骨質(zhì)疏松等藥理作用[2-4]。

杜仲有3種常見的炮制品：生杜仲、鹽杜仲、杜仲炭。中醫(yī)藥理論認(rèn)為杜仲鹽炙后可以增強(qiáng)其補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效，起到“鹽制入腎”的作用[5]。課題組前期研究表明，杜仲鹽炙后可以明顯增強(qiáng)其治療去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的作用[6]，此外，生品和鹽炙品含藥血清均可以促進(jìn)人成骨細(xì)胞增殖和分化的作用，且鹽炙后促進(jìn)作用顯著增強(qiáng)，與其所含的環(huán)烯醚萜類成分有關(guān)[7]。有學(xué)者認(rèn)為杜仲炒炭后的補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨功效較生品更佳[8]，且有研究發(fā)現(xiàn)杜仲炭具有明顯的抗炎作用[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，杜仲鹽炙后京尼平、京尼平苷和京尼平苷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低25%，40%，40%，炒炭后京尼平、京尼平苷和京尼平苷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低98%，70%，70%，說明炮制對其化學(xué)成分的影響顯著[10]。杜仲炮制前后化學(xué)成分的改變，必然會導(dǎo)致藥效的差異。但是目前關(guān)于杜仲不同炮制品的化學(xué)成分差異研究多以少量成分含量測定為主[11-12]，而指紋圖譜研究多集中于不同產(chǎn)地或杜仲藥材的研究[13-14]，缺少對其炮制前后整體化學(xué)成分的比較研究。因此本研究采用HPLC技術(shù)建立杜仲生品、鹽品、炭品的指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA）對杜仲炮制前后進(jìn)行模式識別研究，以期從整體角度評價(jià)杜仲炮制前后的化學(xué)成分變化，為其質(zhì)量控制研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司）;BT25S型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）;AIBOTE電熱套（南京予華儀器設(shè)備有限公司）;高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑

對照品京尼平苷酸（批號：20180201JNPGS）、咖啡酸（批號：20180320KFS）、京尼平苷（批號：20180201JNPG）、松脂醇二葡萄糖苷（批號：20180120SZCEPTTG）、京尼平（批號：20180120JNP）均購于南京世洲生物科技有限公司，純度>98%。

色譜級乙腈（上海ANPEL實(shí)驗(yàn)器材有限公司）;色譜級磷酸（上海阿拉丁生物科技有限公司）;水為超純水;其余試劑均為分析純。

1.3 分析樣品

杜仲生品：十批杜仲生品來源見表1，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為杜仲科植物杜仲（ Eucommia u1moides? Oliv.）的干燥樹皮。

杜仲鹽品：分別稱取十批杜仲生品飲片50 g，照2015年版《中華人民共和國藥典》四部鹽炙法（通則0213）炒至斷絲、表面焦黑色，取出，晾涼。

杜仲炭品：分別稱取十批杜仲生品飲片50 g，照2015年版《中華人民共和國藥典》四部炒炭法（通則0213）用武火炒至表面焦黑色、內(nèi)部焦褐色，并斷絲存性，噴淋清水少許，熄滅火星，取出，晾干。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取杜仲生品、鹽品和炭品粉末（過四號篩）約1 g，精密稱定，加入10倍量水浸泡30 min后，武火煮沸，文火煎煮30 min，濾過。藥渣再加入8倍量，煎煮20 min，濾過，合并2次濾液，定容至25 mL，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取京尼平苷酸、咖啡酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平對照品適量，加入甲醇溶解并稀釋，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為0.168 mg/mL、0.248 mg/mL、0.241 mg/mL、0.174 mg/mL、0.198 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫：25 ℃;體積流量：1 mL/min;流動相：0.3%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，程序如下：0～15 min，95～90% A;15～25 min，90～85% A;25～35 min，85～83% A;35～50 min，83～80% A;50～55 min，80～75% A;55～65 min，75～65% A;65～75 min，65～5% A;進(jìn)樣量：10 μL;檢測波長：238 nm。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一批杜仲生品，按照“2.1項(xiàng)”下制備供試品溶液，按照“2.3項(xiàng)”下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以京尼平苷酸為參照峰，計(jì)算共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果表明，各共有峰相對保留時(shí)間 RSD 均小于0.8%，相對峰面積 RSD 均小于1.1%，結(jié)果表明儀器的精密度符合要求。

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批杜仲生品6份，按照“2.1項(xiàng)”下制備供試品溶液，按照“2.3項(xiàng)”下條件進(jìn)樣，以京尼平苷酸為參照峰，計(jì)算共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果表明，各共有峰相對保留時(shí)間 RSD 均小于1.5%，相對峰面積 RSD 均小于1.2%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性符合要求。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按照“2.3項(xiàng)”下條件進(jìn)樣，以京尼平苷酸為參照峰，計(jì)算共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果表明，各共有峰相對保留時(shí)間 RSD 均小于1.3%，相對峰面積 RSD 均小于1.4%，結(jié)果表明，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 數(shù)據(jù)分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012 A）分析杜仲炮制前后的HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)。采用Simca14.1統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA）。

3 結(jié)果與分析

3.1 指紋圖譜結(jié)果與分析

取30批杜仲樣品，按“2.1項(xiàng)”下方法制備供試品溶液，按“2.3項(xiàng)”下色譜條件檢測，記錄色譜圖。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 A），生成杜仲不同炮制品的對照指紋圖譜如圖1所示，混合對照品高效液相色譜圖如圖2所示。其中生品標(biāo)定了7個(gè)共有峰，鹽品標(biāo)定了7個(gè)共有峰，炭品標(biāo)定了8個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中5個(gè)共有峰。通過杜仲3種不同炮制品對照圖譜可以明顯看出，鹽品和炭品明顯生成了2號峰，生品在2號峰的位置無明顯峰。5號峰（咖啡酸）、8號峰（京尼平）在炮制后峰強(qiáng)明顯減弱。相似度評價(jià)系統(tǒng)采用中位數(shù)計(jì)算杜仲不同炮制品的水提液的指紋圖譜的相似度，其相似度結(jié)果見表2。

3.3 化學(xué)模式識別

3.3.1 聚類分析（HCA）

將杜仲不同炮制品的匹配峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca14.1統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，當(dāng) t 為800時(shí)，杜仲生品、鹽品、炭品明顯分為3類，其中1～10為炭品聚為一類，11～20為生品聚為一類，21～30為鹽品聚為一類。見圖4。

3.3.2 主成分分析（PCA）

將杜仲3種炮制品的指紋圖譜所有峰面積作為變量，采用Simca14.1統(tǒng)計(jì)分析軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行主成分分析（PCA）。杜仲生品、鹽品、炭品明顯分成3類，其中生品之間差異較大，比較分散，經(jīng)鹽炙后差異縮小，經(jīng)炒炭后分散程度明顯縮小，說明炮制過程對杜仲中整體化學(xué)式成分產(chǎn)生了顯著的影響。由生品到鹽品由于炒制的劇烈程度不如由生品到炭品，所以其分散程度由生品到鹽品再到炭品逐漸減小。見圖5。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了杜仲3種不同炮制品（生品、鹽品、炭品）的水提液指紋圖譜，并對其進(jìn)行聚類分析及主成分分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，杜仲3種不同的炮制品明顯聚為3類，且生品的離散度較大，鹽品次之，炭品最小，說明炮制過程對杜仲中的化學(xué)成分產(chǎn)生了較大的影響，且隨著炮制程度的增加使其化學(xué)成分更趨于一致。中藥在臨床使用多入湯劑，指紋圖譜研究以有機(jī)溶劑提取的方式得到的結(jié)果對其臨床應(yīng)用提供參考具有局限性。本實(shí)驗(yàn)建立的杜仲水提液指紋圖譜不僅可以為其質(zhì)量控制提供參考，還可為其不同炮制品的臨床應(yīng)用提供參考。

高效液相色譜指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別方法中的HCA、PCA分析，能夠?qū)Σ煌谥品椒ㄌ幚淼闹兴庯嬈g進(jìn)行快速聚類鑒別和判別分析[15-16]。 從3種炮制品的對照譜圖可以看出，杜仲中的京尼平苷酸、咖啡酸、京尼平苷松脂醇二葡萄糖苷、京尼平在炮制后響應(yīng)均呈下降趨勢，而炮制后在9.1 min和15.5 min附近明顯峰響應(yīng)增加，正是化學(xué)成分的改變導(dǎo)致其可以明顯聚為3類。本實(shí)驗(yàn)建立的杜仲不同炮制品的指紋圖譜可以從整體上區(qū)別杜仲3種不同炮制品（生品、鹽品、炭品），但是有關(guān)于具體的化學(xué)成分的改變，課題組將通過LC-Triple TOF MS/MS技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的杜仲不同炮制品指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別手段可以從整體上表征杜仲炮制前后的化學(xué)成分變化，能夠真實(shí)的反應(yīng)杜仲炮制前后的化學(xué)成分變化，為其質(zhì)量控制研究以及藥效學(xué)變化研究提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：165.

[2]王娟娟，秦雪梅，高曉霞，等.杜仲化學(xué)成分、藥理活性和質(zhì)量控制現(xiàn)狀研究進(jìn)展[J].中草藥，2017，48（15）：3228-3237.

[3]馮晗，周宏灝，歐陽冬生.杜仲的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2015，20（6）：713-720.

[4]KOH W S J，LEE J，LEE IH，et al.Anti-inflammatory effect of Cortex Eucommiae via modulation of the toll-like receptor 4 pathway in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages[J].J Ethnopharmacol，2017，209：255-263.

[5]蔡寶昌.中藥炮制學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：65.

[6] 翁澤斌，顏翠萍，吳育，等.鹽制對杜仲治療去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥影響的研究[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2014，20（12）：1457-1463.

[7]翁澤斌，顏翠萍，高倩倩，等.不同炮制品的杜仲含藥血清及其環(huán)烯_省略_經(jīng)后婦女成骨細(xì)胞增殖與分化的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2015，26（11）：2636-2638.

[8]馬曉鵬，宋立群，陳雅超，等.宋立群教授治療腎衰竭藥對舉要[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2015，43（2）：92-93.

[9]鄭斌，楊瑞，解燕.杜仲炭抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（16）：126-127，165.

[10] 陶益，盛辰，李偉東，等.杜仲不同炮制品化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2014，39（22）：4352-4355.

[11]黨會章，劉磊磊，趙帥.杜仲飲片中京尼平苷酸和京尼平苷的含量測定[J].抗感染藥學(xué)，2014，11（4）：315-317.

[12]李曄，劉峰，李彤暉，等.杜仲藥材含量測定方法的研究[J].西北藥學(xué)雜志，2010，25（5）：348-350.

[13]范彥博，袁明洋，張義生.四川產(chǎn)杜仲藥材高效液相色譜指紋圖譜的建立[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，35（10）：1121-1124.

[14]黃徐英，陳玲，程靜，等.不同產(chǎn)地杜仲藥材水提液高效液相色譜指紋圖譜及其共有模式[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，34（11）：1497-1500.

[15]楊冰月，彭亮，顏永剛，等.HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別分析不同產(chǎn)地款冬花生品與蜜炙品[J].中草藥，2018，49（11）：4991-4997.

[16]孫立麗，王萌，任曉亮.化學(xué)模式識別方法在中藥質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中草藥，2017，48（20）：4339-4345.