王艷 陳勛 李燦 婁婷 周日寶

〔摘要〕 目的 采用響應(yīng)面優(yōu)化（Box-Behnken design， BBD） 法優(yōu)選白及原球莖液體培養(yǎng)基，提高白及種子萌發(fā)形成原球莖的誘導(dǎo)率。方法 采用3水平4因素設(shè)計(jì)BBD實(shí)驗(yàn)，在30 g/L的蔗糖溶液中添加大量元素（MS）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和玉米素（ZT）作為白及原球莖液體培養(yǎng)基，并通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)選4種添加物濃度配比。結(jié)果 BBD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮O(shè)計(jì)成功可用于響應(yīng)面結(jié)果優(yōu)化，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后，在1 mg/L MS、2 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA、0.07 mg/L ZT條件下，白及原球莖誘導(dǎo)率可達(dá)（93.13±0.34）%，與預(yù)測(cè)值95.38%差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。白及原球莖直播種苗存活率良好，長(zhǎng)出的葉片數(shù)、植株高度、莖長(zhǎng)及莖寬均超過(guò)種子直播種苗的數(shù)值。結(jié)論 在基本液體培養(yǎng)基中合理配比4種天然添加物可提高白及原球莖誘導(dǎo)率，進(jìn)而提高種子萌發(fā)率。

〔關(guān)鍵詞〕 白及;原球莖;響應(yīng)面;BBD設(shè)計(jì);誘導(dǎo)率

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R282.2? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.009

白及Bletilla striata （Thunb.） Reichb.f.為蘭科白及屬多年生草本植物，以其假鱗莖入藥，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)血、止血、消腫、收斂等多種功效[1]。白及同時(shí)作為一種景觀植物，花色艷麗，觀賞價(jià)值高，在我國(guó)多地均有栽培[2]。但其栽培存在繁殖周期長(zhǎng)、繁殖效率低、耗種量大等不足，有待于進(jìn)一步提升[3-4]。

無(wú)菌栽培技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了中藥材栽培的發(fā)展[5-6]，采用無(wú)菌萌發(fā)技術(shù)應(yīng)用于白及培養(yǎng)已取得較好效果，已成為今后白及繁殖的重要途徑之一[7-8]。白及的發(fā)育遵循蘭科植物基本發(fā)育規(guī)律，種子發(fā)育成完整植株需經(jīng)歷種胚、原球莖、根狀莖、假鱗莖4個(gè)階段，其中以原球莖最為重要[9]。原球莖是蘭科種子萌發(fā)過(guò)程中的一種形態(tài)學(xué)構(gòu)造，具有遺傳性狀穩(wěn)定且代謝旺盛等特點(diǎn)，通過(guò)原球莖進(jìn)行繼代培養(yǎng)可迅速獲得增殖小苗[10]。因此，如何提高原球莖誘導(dǎo)率已成為白及研究的重點(diǎn)及難點(diǎn)。

目前，在培養(yǎng)基中添加相關(guān)植物激素以促進(jìn)植物種子萌發(fā)形成原球莖已成為研究熱潮[11-12]，但如何對(duì)培養(yǎng)基中天然添加物濃度進(jìn)行合理配比仍有待于進(jìn)一步研究。故本實(shí)驗(yàn)以白及為栽培樣本，采用響應(yīng)面優(yōu)化（Box-Behnken design， BBD）大量元素（MS）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和玉米素（ZT）等添加物濃度進(jìn)行優(yōu)化研究，通過(guò)提高白及原球莖誘導(dǎo)率以促進(jìn)白及種子萌發(fā)，旨在提高白及快速繁殖。

1 材料

1.1? 藥品與試劑

白及種子購(gòu)于四川成都都江堰基地，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周日寶教授鑒定為白及Bletilla striata （Thunb.） Reichb.f.成熟期的蒴果。

所需試劑主要有硝酸鉀（AR，湘中地質(zhì)實(shí)驗(yàn)研究所）;75% 酒精（安徽安特食品股份有限公司）;升汞（AR，貴州省銅仁化學(xué)試劑廠(chǎng)）;無(wú)水氯化鈣、蔗糖、甘氨酸、鹽酸硫胺素、煙酸、肌醇、1-萘乙酸（NAA）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、玉米素溶液（ZT）均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2? 主要儀器

BSC生物安全柜（超凈工作臺(tái)）（蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司）;PYX-800Q-B人工氣候箱（科力儀器）;GB/T 23111分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;YXQ-LS-100G 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)）;CX23奧林巴斯光學(xué)顯微鏡（北京瑞科中儀科技有限公司）。

2 方法

2.1? 培養(yǎng)方法及條件

種子消毒：在超凈工作臺(tái)中，用鑷子打開(kāi)白及果莢，取出種子放入多層紗布包好放入75%酒精中浸泡1 min，再放入用0.1% HgCl2消毒10 min，期間不停搖動(dòng)，無(wú)菌水沖洗5～6次，放在無(wú)菌濾紙吸干表面水分。

白及種子液體培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將消毒滅菌后的白及種子在無(wú)菌環(huán)境下分別接種到所配制的不同液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)。設(shè)4個(gè)變量分別是：MS、6-BA、NAA和ZT。每一個(gè)處理組均含有30 g/L蔗糖，培養(yǎng)條件為：pH5.8，室溫25 ℃，黑暗培養(yǎng)8 d，然后進(jìn)行光照培養(yǎng)37 d，光照強(qiáng)度2 000 Lx，光照時(shí)間12 h/d，共培養(yǎng)45 d。

2.2? BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以前期單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用3水平4因素BBD實(shí)驗(yàn)篩選白及原球莖誘導(dǎo)率最優(yōu)組合。選取MS（A），6-BA（B）、NAA（C）和ZT（D）因素中影響最大的3個(gè)水平，分別以-1、0、1編碼，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

原球莖誘導(dǎo)率=原球莖個(gè)數(shù)/接種種子總數(shù)×100%。

2.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

響應(yīng)曲面模型和顯著性統(tǒng)計(jì)采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用“x±s”表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異。模型的準(zhǔn)確性及顯著性由F值、回歸系數(shù)r和失擬項(xiàng)決定?；貧w系數(shù)R2越接近1，則模型越可靠，預(yù)測(cè)系數(shù)和調(diào)整系數(shù)越高，模型越可靠。

3 結(jié)果

3.1? 統(tǒng)計(jì)分析和模型擬合

BBD實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示。根據(jù)表2的數(shù)據(jù)分析得出BBD模型回歸方程為：

Y=-8.59+60.70×A-0.47×B+39.79×C+1 760.63×D+16.76×A×B-19.04×A×C-327.99×A×D-5.38×B×C-31.73×B×D-169.87×C×D-26.48×A2-2.12×B2-5.45×C2-9 809.07×D2，原球莖誘導(dǎo)率。

由表3可知，模型回歸系數(shù)R2=0.989 1，P<0.01，說(shuō)明該模型回歸極為顯著，可用于白及原球莖誘導(dǎo)率的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)顯著性標(biāo)準(zhǔn)，一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AB、AC、AD、BC、CD以及二次項(xiàng)A2、C2、D2對(duì)白及原球莖誘導(dǎo)率的影響均具有顯著性（P<0.01）。方程的失擬項(xiàng)P值為0.14（P>0.05），表明其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著，說(shuō)明模型良好;Radj2=0.989 1可解釋本模型中98.91%響應(yīng)值的變化;Rpred2=0.942 2，Radj2=0.989 1，二者差異在合理范圍內(nèi)（|Radj2-Rpred2|<0.2），說(shuō)明該模型具有較好的回歸性。精密度為32.9>4進(jìn)一步表明本模型設(shè)計(jì)合理[13]。

3.2? RSM分析

響應(yīng)面三維圖和等高線(xiàn)圖不僅可以解釋自變量之間的相互作用，也可反映變量間的相互作用。通過(guò)觀察曲面的傾斜度確定兩者對(duì)響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高，即坡度越陡，說(shuō)明兩者交互作用越顯著。A、B、C和D對(duì)白及原球莖誘導(dǎo)率的影響，4因素之間的交互曲面均具有較大的傾斜度，說(shuō)明兩兩因素之間的交互作用對(duì)白及原球莖誘導(dǎo)率的影響較大。

3.3? 驗(yàn)證試驗(yàn)

3.3.1? 最優(yōu)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)白及無(wú)菌種子? 根據(jù)擬合方程和方差分析結(jié)果可知白及原球莖誘導(dǎo)率的最優(yōu)條件為：A=1 mg/L、B=2 mg/L、C=0.5 mg/L、D=0.07 mg/L。在此條件下，白及原球莖誘導(dǎo)率達(dá)到最大預(yù)測(cè)值95.38%。為證實(shí)預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性，在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到較高的白及原球莖誘導(dǎo)率，其實(shí)測(cè)值為（93.13±0.34）%，與預(yù)測(cè)值95.38%相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），白及種子形成原球莖狀況進(jìn)一步可說(shuō)明BBD模型預(yù)測(cè)良好，該配比可用于白及種子萌發(fā)形成原球莖的液體培養(yǎng)基。

3.3.2? 原球莖煉苗馴化直播與種子直播種苗長(zhǎng)勢(shì)對(duì)比? 白及種子液體培養(yǎng)60 d后，開(kāi)瓶取出原球莖用自來(lái)水沖洗干凈培養(yǎng)基，放入清水中煉苗馴化處理3 d后直接播種在基質(zhì)為培養(yǎng)土（椰糠等）∶珍珠巖∶蛭石配比為10∶2∶1的苗床上。播種完后用保鮮膜覆蓋穴盤(pán)，控制大棚內(nèi)的各項(xiàng)環(huán)境因素，達(dá)到白及最適宜成苗的條件，并保持大棚內(nèi)通風(fēng)，定期澆水，按時(shí)進(jìn)行田間追肥管理。在白及種子接種在液體培養(yǎng)基的同一天將白及種子直接進(jìn)行同等條件直播培養(yǎng)。兩種方式均培養(yǎng)10個(gè)月后種苗長(zhǎng)勢(shì)。

兩種方式培養(yǎng)栽種10個(gè)月后，采用隨機(jī)5點(diǎn)取樣調(diào)查法，每點(diǎn)隨機(jī)取10株白及苗，每組各取50株進(jìn)行觀測(cè)，觀測(cè)指標(biāo)有真葉片數(shù)、株高、莖長(zhǎng)、莖寬。測(cè)量單株各項(xiàng)指標(biāo)的方差值見(jiàn)表4。白及原球莖播種長(zhǎng)出的葉片數(shù)、植株高度、莖長(zhǎng)及莖寬均超過(guò)種子直播種苗的數(shù)值。

4 結(jié)論

白及在野生狀態(tài)或人工栽培條件下繁殖速度較慢，繁殖系數(shù)低。組培技術(shù)是白及種子萌發(fā)非常有效的一項(xiàng)手段[14]，本研究主要從MS濃度、6-BA濃度、NAA濃度和ZT濃度4個(gè)因素著手，考察其對(duì)白及種子萌發(fā)形成原球莖的影響，并篩選最佳條件。液體培養(yǎng)白及種子萌發(fā)形成原球莖受許多因素的影響，不同培養(yǎng)基配方對(duì)白及種子萌發(fā)形成原球莖的誘導(dǎo)率的影響不同。 本研究采用響應(yīng)面法對(duì)現(xiàn)有的白及種子萌發(fā)形成原球莖的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件優(yōu)化，為更好優(yōu)選出白及原球莖提供技術(shù)支撐。

同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)白及的種子細(xì)小如灰塵，在液體培養(yǎng)時(shí)很難精確計(jì)算白及種子的接種數(shù)量。故本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，按照白及種子相同的懸浮程度，每種處理取相同計(jì)量的白及種子懸浮液進(jìn)行定量接種，基本保證了每組實(shí)驗(yàn)中白及種子總數(shù)的一致性，最大限度降低了因接種密度不同所導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)的誤差。在現(xiàn)有的報(bào)道中采用液體培養(yǎng)白及種子及原球莖的研究逐漸增多，本研究通過(guò)液體培養(yǎng)白及種子及原球莖，以求克服固體培養(yǎng)的弊端，在培養(yǎng)過(guò)程中，種子和原球莖能充分接觸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，加快了種子萌發(fā)和原球莖生長(zhǎng)發(fā)育速度，最終提高了白及種子萌發(fā)率和原球莖誘導(dǎo)率，可為快速生產(chǎn)白及無(wú)菌苗提供有效的技術(shù)參數(shù)，為推動(dòng)白及種苗規(guī)模化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。此外，后期在原球莖需要轉(zhuǎn)接培養(yǎng)時(shí)，將其移栽在自然界中，既提高了發(fā)芽率，而且降低了生產(chǎn)成本，能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的白及種苗，滿(mǎn)足大面積、規(guī)?；绲男枰?，具有生產(chǎn)與經(jīng)濟(jì)上的雙重意義。

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