左勝男 伍參榮 陳超龍 劉碧源 申可佳 譚曉鳳 蔡銳 李珊

〔摘要〕 目的 探討七味白術(shù)散對輪狀病毒（human rotarirus， HRV）感染乳鼠小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞（iEL） CD3+T細胞核內(nèi)抗病毒蛋白表達的影響，進一步闡明該方抗HRV機制。方法 選取5日齡NIH乳鼠168只，隨機分為7組，正常對照組（N組）常規(guī)喂養(yǎng)，其余各組建立HRV腹瀉模型，并分別灌服生理鹽水（M組）、七味白術(shù)散（B組）、病毒唑（Z組）、抑制劑（Y組）、七味白術(shù)散加抑制劑（BY組），病毒唑加抑制劑（ZY組）;分別于用藥后32、40、48 h取各組乳鼠小腸黏膜，采用Western blotting方法測定小腸iEL CD3+T細胞核中雙鏈RVA依賴的蛋白質(zhì)激酶（PKR）、真核翻譯起始子2的α亞基（eIF-2α）、2'，5'-寡腺苷酸合成酶（OAS），RNA酶L（RNaseL）蛋白的表達。結(jié)果 B組乳鼠小腸粘膜iEL胞核中PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表達48 h時明顯高于N組、M組、Y組、BY組、ZY組以及Z組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 七味白術(shù)散能促進感染乳鼠小腸黏膜iEL CD3+T細胞核中抗病毒蛋白PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL的表達，從而實現(xiàn)對HRV的清除作用。

〔關(guān)鍵詞〕 七味白術(shù)散;輪狀病毒;抗病毒蛋白;PKR; eIF-2α

〔中圖分類號〕R289.3? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.007

輪狀病毒（human rotavirus， HRV）是導(dǎo)致5歲以下嬰幼兒急性腹瀉和死亡的重要病原體，全世界每年大約50萬兒童死于該疾病[1]，如何防治輪狀病毒感染性腹瀉也成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的熱點。目前對于輪狀病毒腸炎尚無特效治療藥物[2]，中藥復(fù)方七味白術(shù)散（人參、白術(shù)、茯苓、甘草、葛根、藿香、木香）源自宋朝錢乙《小兒藥證直訣》，是治療小兒腹瀉的經(jīng)典方劑[3]。臨床和實驗研究均表明，其對輪狀病毒引起的腹瀉有很好的治療作用[4-9]。

抗病毒蛋白（AVP）是由干擾素（IFN）通過JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與相應(yīng)的受體結(jié)合，激活信號級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的。AVP包括雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（PKR）、2'，5'-寡腺苷酸合成酶（OAS）、Mx蛋白等。其中最主要的是PKR和OAS：活化的PKR作用于真核細胞翻譯起始子2的α亞基（eIF-2α），使之磷酸化，從而使病毒肽鏈的合成受阻[10-13];OAS能夠活化RNA酶L（RNaseL），降解病毒mRNA[14]。

前期研究已經(jīng)從基因表達的水平證實了七味白術(shù)散能增強HRV感染乳鼠小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞（iEL）IFN-γ及IFN-γR mRNA表達水平，本實驗通過觀察其對HRV感染乳鼠小腸iEL CD3+T細胞核內(nèi)AVP表達的影響，進一步為該藥治療HRV感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

取5日C57BL/6乳鼠168只，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心集體購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SYXK（湘）2013-0005。小鼠購回后置消毒鼠盒中飼養(yǎng)，消毒牛奶人工喂養(yǎng)，保持室溫20～25 ℃。

1.2? 藥物

七味白術(shù)散（組成：人參7.5 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，葛根15 g，藿香15 g，木香6 g，甘草3 g）藥材均購自湖南中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)門診部醫(yī)林藥號。用自來水-單蒸水-雙蒸水分別洗3次，放入三角瓶中，加4倍體積的三蒸水浸泡2 h（人參另泡另煎），煎2次，每次煎30 min。去渣，兩煎液混合，G4濾器過濾，于60 ℃水浴中濃縮成每毫升含原生藥1 g的藥液，密封，隔水煮沸消毒;病毒唑，天津藥業(yè)焦作有限公司，批號：10060112，給藥前用生理鹽水稀釋成1.4 mg/mL;蛋白酪氨酸激酶抑制劑Genistein：給藥前用DMSO溶解后用生理鹽水稀釋成5 mg/mL。

1.3? 細胞與病毒

MA104細胞，人輪狀病毒 HRV（Wa株）由中國科學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)中心段昭軍教授贈送。MA104細胞主要用于HRV（Wa株）擴增，擴增后的病毒保存于液氮，供實驗造模用。

1.4? 試劑及儀器

HRV抗原ELISA試劑盒（武漢博士德公司）; NE-PER胞質(zhì)胞核提取試劑盒（美國PIERCE公司）;蛋白定量試劑盒（Thermo，USA.）;兔抗小鼠PKR、eIF-2α和羊抗小鼠OAS、 RNaseL（Santa Cruz公司）;小鼠β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗（羊抗兔IgG、兔抗羊IgG）（康為公司），ECL顯色液。凝膠電泳儀（DYY-Ⅲ型，北京六一儀器廠），轉(zhuǎn)移電泳槽（VE-186，上海天能）。

1.5? HRV感染乳鼠模型的制備與分組

將168只乳鼠隨機抽出24只乳鼠作為正常對照組（N組），其余乳鼠參照文獻[8]經(jīng)口感染，50 μl/只（濃度100TCID50/100 μL）HRV懸液，N組乳鼠滴入等量細胞生長維持液。HRV感染24 h后，造模組乳鼠均出現(xiàn)不同程度的腹瀉，肛周有大便污染痕跡。收集乳鼠糞便，用鼠輪狀病毒抗原ELISA試劑盒（上海一基實業(yè)有限公司產(chǎn)品）檢測糞便中HRV抗原，擬確定造模成功。

造模成功后的乳鼠，再按隨機數(shù)字法，將造模成功的乳鼠分為 HRV腹瀉模型，并分別灌服生理鹽水（M組）、七味白術(shù)散（B組）、病毒唑（Z組）、抑制劑（Y組）、七味白術(shù)散加抑制劑（BY組）、病毒唑加抑制劑（ZY組），每組24只，加上N組（給予生理鹽水）共7組，分別于造模給藥后的32、40、48 h處死乳鼠取小腸組織以及小腸淋巴細胞檢測抗病毒蛋白。每個時間段檢測分析8只乳鼠。

1.6? 標(biāo)本采集

分別在給藥后32、40、48 h 3個時間點斷頭處死各組乳鼠后，立即取出回盲部至幽門的全部小腸，剝離去除腸系膜和脂肪組織，用Hanks液漂洗。

1.7? CD3+T淋巴細胞的分離

按文獻[15]方法將小腸經(jīng)Hanks液漂洗后，切成1 cm的片段，加入15 mL含2% FCS的RPMI-1640液，置37 ℃水浴震蕩30 min，取出后再用力震蕩15 s，靜置2 min，待腸片下沉，收集所有液體，用150目鋼網(wǎng)過濾2次，收集濾液，將濾液裝入事先制好的尼龍毛柱中流過，收集所有濾過的液體，濃縮制成2×107個/mL的單細胞懸液，將此單細胞懸液于4 ℃ 80×g離心5 min以去除雜質(zhì)，再經(jīng)45%和70% Percoll制成的梯度分離液離心90×g，25 ℃ 20 min，收集45%與70%界面層細胞，用含5% FCS的RPMI-1640洗3次，過免疫磁珠，分離出CD3+T淋巴細胞，備用。

1.8? Western blotting方法測定PKR、eIF-2α、OAS， RNaseL蛋白含量

操作步驟：（1）按試劑盒說明抽提CD3+T淋巴細胞胞核中的蛋白質(zhì);（2）按試劑盒的說明對抽提出的胞核蛋白定量;（3）配制12%分離膠，4%的濃縮膠，上樣，120V下電泳2 h，至溴酚蘭遷移到分離膠底部;（4）轉(zhuǎn)膜，60V轉(zhuǎn)移2 h;（5）5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，加入相應(yīng)的一抗（抗PKR多抗1∶500，抗eIF-2α多抗1∶500，抗OAS多抗1∶500，抗RNaseL多抗1∶500）室溫孵育2 h，TBS洗3次，加入二抗（羊抗兔IgG、兔抗羊IgG，用量1∶500）室溫2 h，TBS洗3次;（6）DAB室溫顯色1～5 min，儀器掃描保存結(jié)果;（7）用凝膠圖像分析軟件Gel-Pro analyzer 4.0對目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值進行分析，以β-actin作為內(nèi)參，以目標(biāo)蛋白與β-actin的IOD（累計光密度）比值計算蛋白相對表達量。

1.9? 免疫組化測定PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表達

操作步驟：（1）新鮮小腸樣本固定于甲醛溶液中;（2）石蠟包埋小腸樣本并切片;（3）石蠟切片置于67 ℃烘箱中，烘片2 h，脫蠟后加3%H2O2，室溫下孵育10 min;（4）一抗室溫孵育2 h;（5）二抗孵育30 min;（6）DAB液（二氨基聯(lián)苯胺），顯微鏡下觀察5 min;（7）蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后拍照觀察分析。

1.10? 統(tǒng)計學(xué)方法

本實驗中測得指標(biāo)均為計量指標(biāo)，用“x±s”表示，采用SPSS 16.0軟件包進行統(tǒng)計分析，組間比較用方差分析，兩兩比較用q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 乳鼠小腸黏膜組織iEL CD3+T細胞核中PKR蛋白表達

表1結(jié)果提示B組PKR蛋白表達隨時間變化，32 h后逐漸升高，40 h達到頂峰，48 h下降（P<0.05）;B組PKR蛋白表達均高于Z組（P<0.05）。BY組PKR蛋白表達高于Y組和M組（P<0.05）;Y組低于M組（P<0.05）。ZY組的32 h PKR蛋白高于M組（P<0.05）;而40 h、48 h PKR蛋白與M組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2? 乳鼠小腸黏膜組織iEL CD3+T細胞核中eIF-2α蛋白表達

從表2結(jié)果可以看出HRV感染后的不同時間乳鼠iELCD3+T細胞核中eIF-2α蛋白相對表達量有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。B組乳鼠小腸黏膜iEL細胞核中 eIF-2α蛋白表達明顯高于N組、M組、Y組、BY組和ZY組（P<0.05）;B組eIF-2α蛋白表達量用藥32 h后逐漸升高，40 h達頂峰，48 h下降，3個時間點比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。B組與Z組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;Z組各時間點eIF-2α蛋白表達與B組比較（P<0.05）。BY組eIF-2α蛋白表達高于Y組和M組（P<0.05）;Y組、ZY組各時間點eIF-2α蛋白表達均低于M組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3? 乳鼠小腸黏膜組織iEL CD3+T細胞核中OAS蛋白表達

表3結(jié)果可以看出不同時間點HRV感染乳鼠iELCD3+T細胞核中OAS蛋白相對表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。B組乳鼠小腸黏膜iEL胞核中各時間點OAS蛋白表達均明顯高于N組、M組、Y組、BY組和ZY組（P<0.05）;B組乳鼠OAS蛋白表達隨時間變化逐漸升高，40 h達到頂峰，48 h下降（P<0.05）;B組OAS蛋白表達與Z組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。BY組OAS蛋白表達高于Y組和M組（P<0.05）;40 h、48 h Y組、ZY組OAS蛋白表達分別與M組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4? 乳鼠小腸黏膜組織iEL CD3+T細胞核中RNaseL蛋白表達

表4各組不同時間點HRV感染乳鼠iEL CD3+T細胞核中RNaseL蛋白相對表達量有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。B組乳鼠小腸黏膜iEL胞核中各時間點RNaseL蛋白表達均明顯高于N組、M組、Y組、BY組和ZY組（P<0.05）;B組RNaseL蛋白表達隨時間變化，32 h后逐漸升高，40 h達到頂峰，48 h下降（P<0.05）;32 h時，B組與Z組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;40、48 h時，B組RNaseL蛋白表達均高于Z組（P<0.05）。BY組RNaseL蛋白表達高于Y組和M組（P<0.05）;Y組RNaseL蛋白表達高于ZY組（P<0.05）;40、48 h ZY組與M組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.5? 免疫組化觀察乳鼠小腸組織PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表達

40 h時， M組小鼠其小腸組織PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表達與N組相比不明顯。B組小鼠其小腸組織PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表達高于N組，M組和Z組小鼠，免疫組化結(jié)果與Western blotting結(jié)果相似。

4 討論

秋末冬初，氣候轉(zhuǎn)冷，小兒在“臟腑柔弱”“成而未全，全而未壯”“脾常不足”的基礎(chǔ)上，感受風(fēng)寒，致脾胃功能失常，水反為濕，谷反為滯，水谷并走大腸而致泄瀉;“脾虛”“濕勝”為其病理基礎(chǔ)。七味白術(shù)散原名白術(shù)散，由人參、白茯苓、炒白術(shù)、藿香葉、木香、甘草、葛根組成，由北宋“兒科之圣”錢乙創(chuàng)制。此方以人參、白術(shù)、甘草之甘溫，補胃和中;木香、藿香辛溫以助脾，茯苓甘淡，分陰陽，利水濕，葛根甘平，倍于眾藥，其氣輕浮，鼓舞胃氣，上行津液，又解肌熱，是治脾胃虛弱泄瀉之圣藥。

輪狀病毒是一種雙鏈RNA病毒，其主要通過誘導(dǎo)TLR3高表達，從而激活下游炎癥信號通路，引起炎癥因子釋放[16-17]。團隊前期研究表明，輪狀病毒主要通過激活TLR3通路及下游NFκB通路，進而激活炎癥反應(yīng)并釋放炎癥因子等，在這一過程中TLR3下游MyD88發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。七味白術(shù)散主要通過選擇性阻斷MyD88，從而抑制下游通路，進一步緩解輪狀病毒引起的炎癥因子釋放。在此過程中七味白術(shù)散對TLR3無顯著作用。在輪狀病毒引起變化的諸多細胞因子中，IFNγ被認為是一種主要的抗輪狀病毒的細胞因子，輪狀病毒腹瀉小兒升高的IFNγ水平與疾病的緩解相關(guān)[19]。但是，目前關(guān)于IFNγ介導(dǎo)輪狀病毒引起腹瀉的機制，以及七味白術(shù)散是否對IFNγ下游信號蛋白產(chǎn)生影響等問題還尚未見報道。

DM Bass[20]發(fā)現(xiàn)lFNγ能阻止輪狀病毒侵入小腸細胞，并抑制其在人類小腸Caco2細胞的復(fù)制。IFNγ通過JAK-STAT途徑與相應(yīng)的受體結(jié)合，激活信號級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)AVP生成，從而干擾病毒的感染和復(fù)制。AVP包括PKR、OAS、RNase L、RNA特異性腺苷脫氨酶（ADAR）和Mx蛋白。其中最主要的是PKR和OAS，這兩種酶的激活均需要病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA。PKR是典型的干擾素誘導(dǎo)的抗病毒蛋白[21]，具有調(diào)節(jié)先天免疫的作用[22]。在絕大多數(shù)細胞中，PKR有一定水平的基礎(chǔ)表達，IFN可通過JAK-STAT途徑誘導(dǎo)PKR的轉(zhuǎn)錄。PKR的氨基末端含有2個保守的dsRNA結(jié)合位點，dsRNA能夠活化PKR，導(dǎo)致PKR的構(gòu)象改變，激活PKR的激酶活性，活化的PKR能夠識別蛋白質(zhì)合成的起始因子eIF-2，并使eIF-2的α亞基51位絲氨酸磷酸化，磷酸化后的eIF失去啟動蛋白質(zhì)翻譯過程的能力，使病毒肽鏈的合成受阻[23-24]。PKR參與機體的抗病毒機制，還與細胞凋亡密切相關(guān)，其機制主要是上調(diào)Fas配體等TNF受體家族成員，死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子FADD以及促凋亡的Bax分子的表達，該作用也可通過eIF-2α和NF-κB介導(dǎo)[25-27]。OAS在靜止細胞中低水平存在，IFN作用時能被強烈誘導(dǎo)。病毒來源的dsRNA能夠激活OAS，OAS在被雙鏈RNA激活后，OAS蛋白將ATP聚合成pppA（2cp5cA）n（n=1或n>1）寡聚體，進而激活潛在的RNaseL，RNaseL能夠降解病毒mRNA，因此，抑制了以RNA作為中介的病毒復(fù)制[28]。

本實驗研究表明，七味白術(shù)散能促進HRV感染乳鼠小腸粘膜iEL胞核中IFNγ下游AVP蛋白的表達?？共《镜鞍譖KR和OAS共同作用，阻斷病毒蛋白質(zhì)合成并降解病毒mRNA，這可能是七味白術(shù)散治療HRV感染性腹瀉的重要機制。

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