潘坤 彭俊 吳佳敏 張又瑋 李建超 吳權(quán)龍 彭清華

〔摘要〕 目的 制備活血散結(jié)方含藥血漿，并研究其不同濃度對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞的毒性作用。方法 以成年健康家兔為對(duì)象，制備活血散結(jié)方含藥血漿。將提取的兔原代RPE細(xì)胞分9個(gè)組，分別為：空白對(duì)照組、正常血漿組、5%含藥血漿組、10%含藥血漿組、20%含藥血漿組、40%含藥血漿組、60%含藥血漿組、80%含藥血漿組、100%含藥血漿組，予以相對(duì)應(yīng)濃度的含藥血漿干預(yù)，CCK8法檢測(cè)含藥血漿對(duì)兔RPE細(xì)胞毒作用。結(jié)果 活血散結(jié)方各濃度含藥血漿對(duì)RPE細(xì)胞有抑制作用，其中5%～20%含藥血漿對(duì)RPE細(xì)胞有較弱的抑制作用，但與正常血漿比較，抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;而40%～100%含藥血漿對(duì)RPE細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，與正常血漿比較，抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 活血散結(jié)方含藥血漿對(duì)RPE細(xì)胞有一定的抑制作用，抑制程度與含藥血漿濃度成量效關(guān)系，可以考慮選擇5%～20%含藥血漿濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的干預(yù)濃度。

〔關(guān)鍵詞〕 活血散結(jié)方;視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞;細(xì)胞毒性;含藥血漿

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R276.7? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.003

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proiiferative vitreoretinopathy，PVR）是孔源性視網(wǎng)膜脫離、糖尿病視網(wǎng)膜病變、玻璃體出血以及眼球后段穿通傷等眼底疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥，目前該病的發(fā)病率在逐年增加[1-3]。PVR的基本病理生理過程主要涉及細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）的合成和膜的收縮[4]。視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞在PVR的發(fā)生和發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，是重要的介導(dǎo)細(xì)胞，也是目前建立PVR模型的主要細(xì)胞[5]。目前許多學(xué)者提出使用藥物預(yù)防PVR的發(fā)展，主要目的在于抗增殖及炎癥[6]，而這些藥物例如秋水仙堿、5-氟尿嘧啶、地塞米松等，或處于實(shí)驗(yàn)臨床階段，或因其藥物毒性、長(zhǎng)期并發(fā)癥等原因，真正應(yīng)用于臨床的很少，故尚無作為防治PVR的臨床常規(guī)藥物[7]。近年來，許多報(bào)道中藥及其制劑防治PVR己取得不錯(cuò)療效[8-12]。湖南中醫(yī)藥大學(xué)彭清華教授從中醫(yī)學(xué)對(duì)PVR的認(rèn)識(shí)及多年來的臨床經(jīng)驗(yàn)出發(fā)，在眼科水血同治的原則和基礎(chǔ)上，提出活血散結(jié)方，已取得良好的療效。本文將探討不同濃度活血散結(jié)方含藥血漿對(duì)兔RPE細(xì)胞活性的影響。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康無眼疾青紫藍(lán)兔4只，雌雄不限，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，由上海市松江區(qū)車墩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物良種場(chǎng)提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SXCK（滬）2012-0008。實(shí)驗(yàn)前行常規(guī)眼科檢查（裂隙燈、間接眼底鏡），排除眼內(nèi)外疾患方進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。含藥血漿制備：成年健康家兔8只，雌雄兼用，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（湘）2015-0004。常規(guī)喂養(yǎng)，控制室溫20～26 ℃，保持空氣流通，相對(duì)濕度55%左右，實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2? 藥物制備

活血散結(jié)方：由三七、丹參、海藻、昆布、鱉甲、地龍配伍組成，飲片由湖南中醫(yī)藥大第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。采用水煎法，分煎2次后混合藥液濃縮至1.025 g/mL生藥濃度，4 ℃以下保存。

1.3? 試劑及儀器

1640培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）;胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）;胰蛋白酶（美國(guó)GIBCO公司）;D-Hank液（美國(guó)GIBCO公司）;聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X 100，上海索萊寶公司）;熒光封片劑（Fluoromount-G，上海索萊寶公司）;小鼠抗兔廣譜細(xì)胞角蛋白（南京vazyme公司）;羊抗兔Alexa Fluor 488（南京vazyme公司）;細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒（七海生物公司）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司3111）;倒置顯微鏡（德國(guó)Motic公司 AE31）;酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-tek公司ELX800）。

2 方法

2.1? 活血散結(jié)方含藥血漿的制備

采用隨機(jī)數(shù)字法將家兔分為活血散結(jié)方組、空白組，每組4只。根據(jù)人與家兔體表面積換算方法計(jì)算（人以60 kg體質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，家兔以1.6 kg體質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)），按等效劑量換算法換算家兔活血散結(jié)方組的等效臨床劑量為20.256 g/kg≈20.3 g/kg?？瞻捉M灌服蒸餾水，均為每日20 mL/kg灌胃，分早晚兩次灌服，連續(xù)灌胃5 d。采血前禁食禁水12 h，末次給藥2 h后，無菌條件下腹主動(dòng)脈取血，收集血液于含3.2%枸緣酸鈉1∶9真空采血管內(nèi)，顛倒混勻后靜置。在3 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液即為含藥血漿。0.22 μm膜濾過分裝，置于-70 ℃超低溫冰箱保存。

2.2? 兔原代RPE細(xì)胞的培養(yǎng)

采用酶消化法獲取兔原代RPE細(xì)胞[13]。取青紫藍(lán)兔耳緣靜脈處空氣栓塞法處死，無菌操作條件下摘除眼球，去凈眼球表面筋膜，生理鹽水充分沖洗，鞏膜穿刺刀沿鋸齒緣后2 mm處刺入，用顯微剪環(huán)形剪開眼球前段，去除角膜、晶狀體以及玻璃體，由視網(wǎng)膜周邊至視乳頭方向輕輕去除視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層。將眼杯置于眼球托上，7-0線在四個(gè)方向縫合固定眼杯，PBS沖洗。滴加胰蛋白酶，放置細(xì)菌培養(yǎng)箱中消化30 min，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)。用吸管輕輕吹打眼球內(nèi)壁使RPE細(xì)胞脫落分散，收集眼杯中細(xì)胞懸液于離心管中。胰酶消化，離心，棄去上清液，加入10%胎牛培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打分散，將RPE細(xì)胞調(diào)整為4×104～5×104個(gè)/mL細(xì)胞的密度，并接種于25 mL培養(yǎng)瓶，在37 ℃、5%CO2和相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后每3天更換培養(yǎng)液，直到細(xì)胞融合。當(dāng)細(xì)胞貼壁鋪滿大部分瓶底即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.3? 兔原代RPE細(xì)胞的鑒定

Cytokeratin-8特異性抗體免疫熒光法[14]進(jìn)行鑒定。將四片玻璃片蓋于24孔板，每孔加1 mL培養(yǎng)基，取上述“2.2”對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第2代細(xì)胞約5×104個(gè)/mL細(xì)胞進(jìn)行爬片，置培養(yǎng)箱過夜。待細(xì)胞鋪平貼壁后，用4%PFA于室溫固定30 min。取50 μL破膜封閉液于防水膜上，蓋于細(xì)胞上，室溫放置1 h。取50 μL小鼠抗兔廣譜細(xì)胞角蛋白一抗滴于防水膜上，蓋于細(xì)胞上，放置4 ℃環(huán)境下過夜。將玻片取出用PBS沖洗。取羊抗兔二抗，滴50 μL于防水膜上，蓋于細(xì)胞上，室溫放置2 h，操作過程注意避光并保持細(xì)胞濕潤(rùn)。2 h后將玻片用PBS沖洗，吸干多余水分，封片并于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2.4? CCK8法檢測(cè)活血散結(jié)方含藥血漿對(duì)兔RPE細(xì)胞的毒性作用

取96孔板培養(yǎng)板，平行接種9組：空白對(duì)照組、正常血漿組、5%含藥血漿組、10%含藥血漿組、20%含藥血漿組、40%含藥血漿組、60%含藥血漿組、80%含藥血漿組、100%含藥血漿組，每組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔。收集對(duì)數(shù)期RPE細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 μL，5%CO2、37 ℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，加入用無血清培養(yǎng)基配制的不同濃度的含藥血漿，培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL試劑盒中7sea-cell counting kit溶液，同步設(shè)調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光值（OD），并計(jì)算。

細(xì)胞增殖抑制率=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值/空白組OD值）]×100%。

2.5? 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以“x±s”表示。行ANOVA單因素方差分析，樣本間的兩兩比較用LSD檢驗(yàn)或者Dunnett檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 兔RPE細(xì)胞鑒定

Cytokeratin-8特異性抗體免疫熒光法結(jié)果顯示：熒光顯微鏡下觀察RPE細(xì)胞，熒光遍及胞質(zhì)，細(xì)胞角蛋白染色呈強(qiáng)陽性。

3.2? 含藥血漿對(duì)RPE細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響

倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，空白對(duì)照組與正常血漿組細(xì)胞分布較為密集，實(shí)驗(yàn)各組中5%～20%含藥血漿組細(xì)胞與正常組相比，細(xì)胞密度無明顯減小;而40%～100%含藥血漿各組細(xì)胞活性受到一定的抑制，細(xì)胞密度減小，并呈一定的量效關(guān)系。

3.3? CCK8法檢測(cè)活血散結(jié)方含藥血漿對(duì)兔RPE細(xì)胞的毒性作用

如表1所示，含藥血漿干預(yù)RPE細(xì)胞48 h后細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示為5%～20%的含藥血漿組細(xì)胞活力OD值與正常組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），40%～100%的含藥血漿各組細(xì)胞活力OD值與正常血漿組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

4 討論

中醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)對(duì)PVR無相應(yīng)病名的記載，缺乏對(duì)其病機(jī)的闡述，因其為有形之物，類似中醫(yī)學(xué)“積聚”范疇，又因PVR各階段癥狀差異，可歸屬于“暴盲”“云霧移睛”和“視瞻昏渺”范疇[15]。目前研究認(rèn)為該病與“癥瘕”的病理病機(jī)相似[16]，與肝腎脾三臟密切相關(guān)[17]，同時(shí)彭清華教授還提出外傷PVR的病機(jī)為血水互結(jié)[18]。活血散結(jié)方由三七、丹參、鱉甲、地龍、昆布、海藻等中草藥組成，方中三七化瘀止血活血，丹參活血祛瘀，入肝經(jīng)血分，二藥合用活血化瘀，共為君藥;鱉甲軟堅(jiān)散結(jié)，入肝腎兩經(jīng)，與君藥合用加強(qiáng)活血化瘀散結(jié)之功，為方中臣藥;地龍通行經(jīng)絡(luò)，清熱利水，昆布、海藻消痰軟堅(jiān)，利水消腫，入肝腎兩經(jīng)，三藥合用助化痰軟堅(jiān)，利水散結(jié)之功。全方共奏活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)之功，使眼內(nèi)瘀血痰結(jié)之有形之物利散，改善眼底情況提高患者視功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)活血散結(jié)方中中藥多具有抗凝、抗纖維、抑制細(xì)胞異常增殖的作用[10，19]。

有研究表明，血漿藥理學(xué)的半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是目前中藥復(fù)方藥理機(jī)制有效的研究方式[20]。本研究采取血漿藥理學(xué)方法[21]，不同濃度活血散結(jié)方含藥血漿干預(yù)RPE細(xì)胞48 h后檢測(cè)細(xì)胞毒性。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)5%～20%含藥血漿干預(yù)的RPE細(xì)胞密度變化不大，而40%～100%含藥血漿干預(yù)下的RPE細(xì)胞受到一定的抑制，細(xì)胞密度下降;CCK8法檢測(cè)顯示含藥血漿對(duì)RPE細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，且存在一定量效關(guān)系（正相關(guān)），其中5%～20%含藥血漿對(duì)細(xì)胞有較弱的抑制作用，與正常血漿組比較，抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;而40%～100%含藥血漿對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，與正常血漿比較，抑制率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。綜合考慮，活血散結(jié)方含藥血漿可以一定程度抑制RPE細(xì)胞，可選擇抑制率較低的5%～20%含藥血漿濃度作為后續(xù)研究的干預(yù)濃度，進(jìn)一步探討PVR發(fā)生、發(fā)展過程中RPE細(xì)胞的作用機(jī)制。

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