李隱俠　馮小品　張莉　張俊　錢(qián)勇　孟春花　王慧利　仲躋峰　曹少先

摘要：湖羊是中國(guó)南方唯一的綿羊品種，耐濕熱是其重要的特色性狀之一。但目前關(guān)于其耐濕熱機(jī)制尚不清楚。本研究以湖羊?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)鑒定熱應(yīng)激前后下丘腦組織中的新基因及其差異表達(dá)，并通過(guò)不同數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)和分析，進(jìn)行新基因功能注釋。結(jié)果表明，熱應(yīng)激前后在湖羊下丘腦組織中共檢測(cè)到1990個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，通過(guò)功能注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)1344個(gè)新基因。在熱應(yīng)激組和對(duì)照組湖羊中，差異表達(dá)新基因186個(gè)，其中130個(gè)新基因表達(dá)上調(diào)，56個(gè)新基因表達(dá)下調(diào)，通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)這些基因分別與細(xì)胞免疫、繁殖、生長(zhǎng)代謝及相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)。Real-time PCR驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，10個(gè)熱應(yīng)激前后表達(dá)差異基因中有9個(gè)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。這些結(jié)果為綿羊基因組的進(jìn)一步完善及基因功能的挖掘提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為全面解析綿羊熱應(yīng)激的分子機(jī)制提供更多的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：湖羊;熱應(yīng)激;下丘腦;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;real-time PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：Q781

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-4440（2019）02-0363-07

熱應(yīng)激是指高溫環(huán)境下，動(dòng)物機(jī)體對(duì)熱環(huán)境刺激產(chǎn)生的非特異性生理反應(yīng)的總稱(chēng)。研究結(jié)果表明，影響家畜生產(chǎn)性能的主要環(huán)境因素有溫度、濕度、太陽(yáng)輻射和風(fēng)速[2]，在以高太陽(yáng)輻射和高溫著稱(chēng)的熱帶地區(qū)，熱應(yīng)激是一個(gè)限制動(dòng)物發(fā)育和生產(chǎn)的主要因素[3]。研究結(jié)果表明，急性熱應(yīng)激使雞生長(zhǎng)性能下降，營(yíng)養(yǎng)成分重分配，脂肪沉積增加[4-5];高溫環(huán)境破壞蛋雞內(nèi)分泌系統(tǒng)進(jìn)而妨礙生殖活動(dòng)[6];熱應(yīng)激影響綿羊的產(chǎn)奶量和繁殖性能[7-8]。

熱應(yīng)激原因很簡(jiǎn)單，但其影響和調(diào)控機(jī)制到目前為止尚不清楚。通過(guò)垂體將神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)連接起來(lái)的下丘腦組織是一個(gè)調(diào)節(jié)體溫的關(guān)鍵中樞[9]。眾所周知，下丘腦的前視區(qū)（POA）和前下丘腦區(qū)（AH）是體溫調(diào)節(jié)中心，下丘腦區(qū)域如室旁下丘腦核（PVN）、視神經(jīng)核（SO）和外側(cè)下丘腦在熱應(yīng)激狀態(tài)下被激活。熱應(yīng)激狀態(tài)下，下丘腦通過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺軸、交感神經(jīng)系統(tǒng)和其他神經(jīng)內(nèi)分泌途徑保存或者消散熱量，從而調(diào)節(jié)動(dòng)物體溫[10]。

湖羊是中國(guó)南方主要的綿羊品種，具有非常重要的優(yōu)良特性，在中國(guó)低繁殖力綿羊品種遺傳改良和新品系培育中做出了一定的貢獻(xiàn)，其中耐濕熱是眾多優(yōu)良特性之一。本研究以湖羊下丘腦組織為研究對(duì)象，在熱應(yīng)激狀態(tài)和非熱應(yīng)激狀態(tài)下，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)、參考基因組比對(duì)技術(shù)挖掘湖羊新轉(zhuǎn)錄本，解析調(diào)控湖羊熱應(yīng)激的差異表達(dá)新基因，并進(jìn)行功能注釋?zhuān)瑸檫M(jìn)一步解析熱應(yīng)激調(diào)控的分子機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

一周歲健康、體質(zhì)量[（33.00+1.58）kg]相近的湖羊母羊6只，急性熱應(yīng)激組和對(duì)照組各3只，自由采食和飲水。急性熱應(yīng)激組溫度42℃ 左右4 h，熱應(yīng)激模型和溫度參照文獻(xiàn)[11];對(duì)照組溫度22℃ 左右。基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。

1.2 樣品采集及RNA提取

熱應(yīng)激組和對(duì)照組湖羊處理后立即屠宰，取完整的下丘腦組織置于液氮中貯存。在液氮中將整個(gè)下丘腦組織研磨完全，用Trizol 法提取總RNA，并分別采用Nanodrop、Qubit 2.0和Agilent 2100方法檢測(cè)RNA樣品的純度、濃度和完整度等，符合測(cè)序要求的RNA送往北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 cDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

使用NEBNext UltraTM RNA文庫(kù)試劑盒（NEB，美國(guó)），按照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，具體步驟參照文獻(xiàn)[13]。應(yīng)用llumina Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的eDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序讀取長(zhǎng)度為125 bp（雙末端測(cè)序）。

1.4 RNA-seq分析

將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾獲得高質(zhì)量的Cleandata，利用TopHat2將Clean reads 與參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，并統(tǒng)計(jì)比對(duì)效率。使用Cufflinks軟件對(duì)新轉(zhuǎn)錄本和新基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量。同時(shí)對(duì)差異表達(dá)基因（DEG）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以差異倍數(shù)（FC）≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.01為標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 功能注釋

使用BLAST軟件將差異表達(dá)新基因與Nr、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，使用KOBAS2.0得到新基因的KEGG orthology結(jié)果，預(yù)測(cè)完新基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列后使用HMMER軟件與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得新基因的注釋信息。

1.6 Real-time PCR

以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相對(duì)應(yīng)的RNA為模板，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-time PCR反應(yīng)體系為2.0 μleDNA模板，10 U的上下游引物各0.4 μl，2 ChamQ SYBR qPCR Master Mix10.0 μl。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 預(yù)變性30s;95℃ 10s，60℃ 30s，40個(gè)循環(huán);95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果

完成6只湖羊下丘腦組織的轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得48.66 Gb Clean data，Q30堿基百分比在89.79%以上，得到大量高質(zhì)量原始數(shù)據(jù)。分別將各樣本的Cleanreads與綿羊參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)效率從65.05%到71.20%不等。

2.2 新基因預(yù)測(cè)及數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

通過(guò)與綿羊參考基因組（Oar_v4.0）進(jìn)行序列比對(duì)，在2組湖羊下丘腦組織中共檢測(cè)到1990個(gè)新基因，其中綿羊以外數(shù)據(jù)庫(kù)被注釋的新基因?yàn)?344個(gè)。新基因在不同數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋?zhuān)Y(jié)果發(fā)現(xiàn)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)新基因數(shù)量最多，達(dá)1342個(gè)，而COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的新基因數(shù)量最少，為78個(gè)（表1）。Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中新基因同源物種分布結(jié)果顯示約99.98%新轉(zhuǎn)錄本注釋到最高的10個(gè)物種（圖1），即牛（Bostaurus）（31.22%）、野牦牛（Bos mutus）（21.16%）、綿羊（Ovisaries）（13.34%）、中國(guó)水牛（Bubalus bubalis）（5.51%）、山羊（Capra hircus）（5.44%）、藏羚羊（Pantholops hodgsonii）（4.84%）、野牛（Bison bison）（3.87%）、黑狐（Pteropus alecto）（1.12%）、海豚（Tursiops truncatus）（1.04%）和豬（Sus scrofa）（0.89%）。

2.3 新基因GO分類(lèi)

GO分類(lèi)發(fā)現(xiàn)690個(gè)新基因分別分類(lèi)到50個(gè)基因本體（GO）條目中，細(xì)胞組分19個(gè)、分子功能13個(gè)和生物學(xué)過(guò)程18個(gè)（圖2），其中動(dòng)物生長(zhǎng)、繁殖、免疫系統(tǒng)、代謝及信號(hào)通路等生物學(xué)過(guò)程新基因所占比例最大，細(xì)胞組分次之，分子功能最少。

2.4 熱應(yīng)激前后差異表達(dá)新基因的篩選和注釋

對(duì)熱應(yīng)激和對(duì)照組湖羊的下丘腦組織差異表達(dá)新基因進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，兩組間共有186個(gè)新基因表達(dá)差異顯著，其中上調(diào)基因130個(gè)，下調(diào)基因56個(gè)。186個(gè)新基因只有146個(gè)在不同數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋?zhuān)渲性贜r數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋的差異表達(dá)新基因數(shù)目最多（146個(gè)），在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中最少（6個(gè)）（表2）。

45個(gè)差異表達(dá)新基因參與到65個(gè)信號(hào)通路，包含氧化磷酸化、MAPK信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、代謝通路等。根據(jù)GO分類(lèi)注釋信息發(fā)現(xiàn)，其中參與湖羊生長(zhǎng)調(diào)控的新基因有4個(gè)，參與繁殖調(diào)控的新基因有1個(gè)，參與免疫調(diào)控的新基因有2個(gè)，參與代謝調(diào)控的新基因有9個(gè)，參與氧化應(yīng)激調(diào)控的新基因有21個(gè)，對(duì)應(yīng)新基因編號(hào)及參與功能見(jiàn)表3。

2.5 熱應(yīng)激前后差異表達(dá)新基因的Real-time PCR驗(yàn)證

為了進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的差異表達(dá)新基因在熱應(yīng)激前后表達(dá)量差異，設(shè)計(jì)12對(duì)引物（表4），以熱應(yīng)激前后湖羊下丘腦組織cDNA為模板，Real-time PCR驗(yàn)證熱應(yīng)激前后基因表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在10個(gè)表達(dá)有差異的新基因組中，9個(gè)基因的驗(yàn)證結(jié)果都與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果一致，Ovis_aries_newGene_12971基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示熱應(yīng)激后該基因表達(dá)量顯著下降，而Real-time PCR結(jié)果顯示該基因熱應(yīng)激后表達(dá)量下降，但是未達(dá)到顯著水平（圖3）。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序熱應(yīng)激前后基因表達(dá)差異與Real-time PCR驗(yàn)證熱應(yīng)激前后基因表達(dá)差異比較見(jiàn)表5。

3 討論

Marai等[13]根據(jù)溫濕指數(shù)（THI）將熱應(yīng)激劃分為不同的等級(jí)：22.2～23.3是普通熱應(yīng)激、23.4～25.6為嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激>25.6屬于極嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激。研究結(jié)果表明不同動(dòng)物誘發(fā)熱應(yīng)激的溫度不同，對(duì)于羊而言，通常認(rèn)為羊的臨界溫度為25～30℃ ，當(dāng)綿羊暴露于超過(guò)30℃時(shí)被認(rèn)為發(fā)生熱應(yīng)激[14]。Srikandakumar等[15]在溫度為35.5～43.9℃ 時(shí)發(fā)現(xiàn)白毛澳大利亞美利奴產(chǎn)生熱應(yīng)激，呼吸頻率上升到每1min128次。DaCosta等在溫度為24～45℃ 的氣候室中觀察32只Polwarth母羊在不同級(jí)別熱應(yīng)激條件下飲食、反芻情況[11]。本研究根據(jù)Srikandaku-mar[15]和DaCosta[11]的研究模型選擇熱應(yīng)激時(shí)間和溫度對(duì)湖羊進(jìn)行熱應(yīng)激研究。通過(guò)對(duì)對(duì)照組和熱應(yīng)激組湖羊下丘腦組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，與之前的綿羊參考基因組序列相比，共檢測(cè)到1990個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，其中有數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的基因1344個(gè)。這些新轉(zhuǎn)錄本比對(duì)到GO、Nr、Swiss-Prot、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)量分別為689、1344、347和537，與這些數(shù)據(jù)庫(kù)的成功比對(duì)為進(jìn)一步證實(shí)這些新基因的存在提供了理論依據(jù)。同源物種比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，與牛的相似基因最多（31.22%），與綿羊的相似基因?yàn)?3.34%，此結(jié)果一方面表明同為反芻動(dòng)物的牛和羊在基因組序列中的高度保守性[1617]，同時(shí)也表明現(xiàn)有的綿羊參考基因組的不完整性，本研究鑒定的綿羊新基因?qū)M(jìn)一步完善綿羊參考基因組具有非常重要的意義。

研究結(jié)果表明，當(dāng)動(dòng)物經(jīng)歷熱應(yīng)激后，動(dòng)物體溫上升，從而觸發(fā)進(jìn)化保守的能調(diào)控多個(gè)細(xì)胞活性的熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)調(diào)節(jié)基因，包括蛋白折疊、蛋白講解轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、DNA修復(fù)和復(fù)制等變化[1819]，調(diào)控相關(guān)基因通路的變化，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的氧化應(yīng)激[20]、生長(zhǎng)[21]、繁殖[22]、代謝[23].免疫[24]等。本研究結(jié)果經(jīng)過(guò)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激前后差異表達(dá)的新基因中有45個(gè)新基因參與到65個(gè)信號(hào)通路，包含氧化磷酸化、MAPK信號(hào)通路，鈣信號(hào)通路、代謝通路等。研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激能激活MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而阻斷細(xì)胞生長(zhǎng)和引發(fā)凋亡[25]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其參與熱應(yīng)激誘導(dǎo)的精子損傷[26]，進(jìn)而調(diào)控動(dòng)物的繁殖。根據(jù)GO分類(lèi)注釋信息，發(fā)現(xiàn)參與湖羊生長(zhǎng)調(diào)控的新基因有4個(gè)，參與繁殖調(diào)控的新基因有1個(gè)，參與免疫調(diào)控的新基因有2個(gè)，參與代謝調(diào)控的新基因有9個(gè)，參與氧化應(yīng)激調(diào)控的新基因有21個(gè)。該結(jié)果表明，存在潛在的新基因，其在湖羊熱應(yīng)激后參與調(diào)控湖羊生長(zhǎng)、繁殖、免疫、代謝和氧化應(yīng)激等功能。

本試驗(yàn)對(duì)湖羊熱應(yīng)激前后下丘腦組織差異表達(dá)新基因進(jìn)行GO功能分類(lèi)和信號(hào)通路分析，有助于進(jìn)一步解析調(diào)控湖羊熱應(yīng)激的分子機(jī)制，為盡早挖掘出完備的湖羊耐濕熱特性的分子機(jī)理提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃艷，周阿容，池文文，等.果蠅熱應(yīng)激生理機(jī)制研究進(jìn)展[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，49（5）：912-921.

[2]HULME P E.Adapting to climate change：is there scope for ecological management in the face of a global threat[J].Journal ofApplied Ecology，2005，42：784-294.

[3]MCMANUS C，HERMUCHE P，PAIVA S R，et al.Geographical distribution of sheep breeds in brazil and their relationship with climatic and environmental factors as risk classification for conservation[J].Brazilian Journal Science and Technology，2014，1：1-15.

[4]劉梅.急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能及脂肪代謝的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23（5）：862-868.

[5]唐姣玉，謝宇潔，劉兆輝，等.大蒜素對(duì)熱應(yīng)激湘黃雞生產(chǎn)性能及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，33（3）：638-641.

[6]TU W L，CHENGC Y，WANGS H，et al.Profiling of differential gene expression in the hypothalamus of broiler-type Taiwan country chickens in response to acute heat stress[J].Theriogenology，2016，85（3）：483-494.

[7]MARAI I F M，EI-DARAWANY A A，F(xiàn)ADIEL A，et al.Physiological traits as affected by heat stress in sheep-a review[J].Small Ruminant Research，2007，71：1-12.

[8]FINOCCHIARO R，VAN KAAMJ BC H M，PORTOLANOB，et al.Effect of heat stress on production of Mediterranean dairy sheep[J].Journal of Dairy Science，2005，88：1855-1864.

[9]HAMMEL H T，JACKSON D C，STOLWIJKJ A，et al.Temperature regulation by hypothalamic proportional control with an adjust-able set point[J].Journal of Applied Physiology，1963，18：1146-1154.

[10]MILLER D B，O'CALLAGHAN J P.Neuroendocrine aspects of the response to stress[J].Metabolism，2002，51：5-10.

[11]DA COSTA MJ，DA SOLVA RG，DE SOUZA R C. Effect of air temperature and humidity on ingestive behavior of sheep[J].International Journal of Biometeorology，1992，36（4）：218-222.

[12]李隱俠，王慧利，鄧唯，等.高溫環(huán)境下湖羊直腸溫度和血液生化指標(biāo)的監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2018，45（1）：271-277.

[13]MARAIIF M，AYYAT MS，ABD EI-MONEM U M.Growth performance and reproductive traits at first parity of New Zealand White female rabbits as affected by heat stress and its alleviation，under Egyptian conditions[J].Tropical Animal Health and Production，2001，33：451-462.

[14]FUQUAY J W.Heat stress as it affects animal production[J].Journal of Animal Science，1981，52（1）：164-174.

[15]SRIKANDAKUMAR A，JOHNSON E H，MAHGOUB O.Efect of heat stress on respiratory rate，rectal temperature and blood chemistry in Omani and Australian Merino sheep[J].Small RuminantResearch，2003，49：193-198.

[16]李隱俠，張俊，錢(qián)勇，等.烏骨綿羊NR5A2基因編碼區(qū)序列克隆及特征分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，30（6）：1375-1382.

[17]張春香，張國(guó)林，郭麗娜，等.基于高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的山羊睪丸和附睪頭差異表達(dá)基因分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，45（3）：391-401.

[18]FEDER M E，HOFMANN G E.Heat-shock proteins，molecular chaperones，and the stress response：evolutionary and ecological physiology[J].Anual Review of Physiology，1999，61：243-282.

[19]KREGEL K C.Heat shock proteins：modifying factors in physiological stress responses and acquired thermotolerance[J].Jourmal of Applied Physiology，2002，92（5）：2177-2186.

[20]ALEMUT W，PANDEY H O，SALILEW WONDIM D，et al.Oxidative and endoplasmic reticulum stress defense mechanisms of bovine granulosa cells exposed to heat stress[J].Theriogenology，2018，110：130-141.

[21]PRAGNA P，SEJIAN V，BAGATH M，et al.Comparative assessment of growth performance of three different indigenous goatbreeds exposed to summer heat stress[J].Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition （Berl），2018，102（4）：825-836.

[22]RAHMAN M B，SCHELLANDER K，LUCENO N L，et al.Heat stress responses in spermatozoa：Mechanisms and consequences forcattlefertility[J].Theriogenology，2018，113：102-112.

[23]GANESAN S，SUMMERS C M，PEARCE S C，et al.Short-term heat stress altered metabolism and insulin signaling in skeletalmuscle[J].Journal of Animal Science，2018，96（1）：154-167.

[24]SAEED-ZIDANE M，LINDEN L，SALILEW-WONDIM D，et al.Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism inbovine granulosa cells exposed to oxidative stress[J].PLoS ONE，2017，12（11）：e0187569.

[25]WADA T，PENNINGER J M.Mitogen-activated protein kinases in apoptosis regulation[J].Oncogene，2004，23（16）：2838-2849.

[26]RAHMAN M B，VANDAELE L，RIJSSELAERE T，et al.Bovine spermatozoa react to in vitro heat stress by activating the mitogen-activated protein kinase 14 signaling pathway[J].ReproductionFertility and Development，2014，26（2）：245-257.