朱守晶　史文娟

摘要：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）是磷酸戊糖代謝途徑的關(guān)鍵限速酶，為探討G6PDH基因在苧麻耐鎘機(jī)制中的作用，本研究在苧麻鎘脅迫轉(zhuǎn)錄組的基礎(chǔ)上，采用RACE方法從苧麻（BoehmerianiveaL.）品種中苧一號中克隆到BnG6PDHI基因（GenBank登錄號為MG941010）的全長eDNA序列，該基因開放讀碼框為1554bp，編碼517個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為59250，等電點為5.92。BnG6PDHI編碼的氨基酸與川桑（XP_010111634.1）、棗（XP_015878928.1）、甜櫻桃（XP_021825040.1）、蘋果（XP_008362117.1）和梅（XP_008231184.1）的胞質(zhì)型G6PDH蛋白的相似性較高，相似度分別為92%.91%、89%、88%和88%。組織表達(dá)特異性分析結(jié)果表明，BnG6PDHI在苧麻葉中的表達(dá)量最高，其次為莖，根部的表達(dá)量最低。鎘脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析結(jié)果表明，BnG6PDHI的顯著表達(dá)受鎘的誘導(dǎo)，表達(dá)量隨著鎘質(zhì)量濃度的增加而增加。以上結(jié)果表明，BnMYBI是一個鎘應(yīng)答基因，可能在植物對鎘脅迫的適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：苧麻;葡萄糖-6-磷酸脫氫酶;鎘響應(yīng)基因BnG6PDHI;基因克隆;表達(dá)分析

中圖分類號：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0262-09

近年來隨著采礦、冶金等工業(yè)的發(fā)展，以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化肥農(nóng)藥的過量施用，中國農(nóng)田土壤的重金屬污染問題日益顯現(xiàn)。鎘（Cd）是一種常見的有毒重金屬，生物遷移性很強(qiáng)。土壤中的鎘易被植物根系吸收并積累，不僅造成作物生長減緩，產(chǎn)量和品質(zhì)降低，還可通過食物鏈在人體組織器官中積累，嚴(yán)重威脅人類健康[57。植物修復(fù)技術(shù)因其成本低、環(huán)境友好等特點，是農(nóng)田鎘污染修復(fù)的有效方法之一，研究植物耐受和積累重金屬鎘的分子機(jī)制，對于吸，鎘植物的遺傳改良具有重要意義。

戊糖磷酸途徑（Pentose phosphate pathway，PPP）是植物糖代謝的重要途徑，主要提供核酸代謝所需的磷酸戊糖及還原力[即還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）]，一些中間產(chǎn)物則參與脂肪酸和氨基酸的代謝。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）是植物戊糖磷酸途徑的關(guān)鍵限速酶，在植物的生長發(fā)育中起到非常重要的作用。1994年，Graeve等首次從馬鈴薯eDNA文庫中獲得了質(zhì)體G6PDH基因。隨后，研究者們陸續(xù)從擬南芥、小麥、煙草、苜蓿中克隆到了植物G6PDH基因。近年來的許多研究結(jié)果表明，G6PDH與植物的生長發(fā)育和對多種外界環(huán)境脅迫的應(yīng)答有密切關(guān)系。Scharte等將擬南芥G6PDH基因轉(zhuǎn)入煙草，提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性，其原因可能是G6PDH能夠通過調(diào)節(jié)抗壞血酸（Ascorbicacid，ASA）和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量來清除植物體內(nèi)多余的ROS，增強(qiáng)了植物的耐旱性。林元震等在煙草中超表達(dá)甜楊PsG6PDH基因，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性。此外，鹽脅迫氧化脅迫金屬離子脅迫低溫脅迫、水分脅迫、病原菌侵染等生物或非生物脅迫，均可引起植物G6PDH活性或基因表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。

苧麻（Boehmeria nivea L.）為蕁麻科苧麻屬多年生宿根性草本植物，其纖維是中國重要的紡織原料，因其優(yōu)越的纖維品質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于紡織，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。同時，苧麻還具有生物量大、生長迅速、耐瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)等特點，特別是對重金屬鎘具有較強(qiáng)的耐受能力。G6PDH廣泛參與植物生長發(fā)育和對逆境脅迫響應(yīng)等多種生理過程，但關(guān)于G6PDH在苧麻耐鎘分子機(jī)制中的研究報道較少。本研究擬從鎘脅迫下苧麻轉(zhuǎn)錄組中篩選出一個受鎘脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的G6PDH基因，利用RACE技術(shù)克隆該基因的全長eDNA序列，在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，利用熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)研究該基因在苧麻不同組織器官及鎘脅迫下的表達(dá)特性，為苧麻耐鎘分子機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其處理

供試植物材料為苧麻栽培品種中苧一號，來自宜春學(xué)院苧麻資源圃。在中苧一號旺長期，選取一蔸中的3個單株，分別取其須根、中段莖及嫩梢葉，作為3個生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后置于-80C保存，用于基因的組織特異性表達(dá)特性分析;選取株高15cm左右，長勢較為一致的中苧一號扦插苗，置于裝有1/2Hoagland營養(yǎng)液的三角瓶中，于培養(yǎng)室中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)（培養(yǎng)條件：溫度28C，相對濕度50%～60%，光周期為12h光照/12h黑暗，每2d更換1次營養(yǎng)液），約14d后向營養(yǎng)液中添加CdCl，進(jìn)行脅迫處理，鎘處理質(zhì)量濃度分別為0mg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L，處理24h，剪取葉片，-80C保存，用于鎘脅迫下的基因表達(dá)分折。

1.2 生化試劑

植物總RNA提取試劑pBIOZOL購自北京Bio Flux公司，PrimeScrip RT reagent Kit with gDNA E-raser、SYBRO Premix Ex TaqII、pMD18-T載體購自TaKaRa公司（日本），TransTaq-T DNA Polymerase、DNA Marker、Trans-Tl Phage Resisitant Chemically Competent Cell、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物合成及測序由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成，其余試劑均為國產(chǎn)分析純或者化學(xué)純。

1.3 RNA提取及cDNA合成

苧麻不同組織器官和不同質(zhì)量濃度鎘處理樣品總RNA的提取按照pBIOZ0L植物總RNA提取試劑的操作流程進(jìn)行;第一鏈cDNA的合成按照Pri-meScriptMRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.4 BnG6PDHl基因3'端的克隆

根據(jù)鎘脅迫^下苧麻轉(zhuǎn)錄組中的Unigene序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計2條巢式正向特異性引物BnG6PDHI-F1和BnG6PDHl-F2，對應(yīng)的反向引物為QO和QI。利用接頭引物QT以苧麻根莖、葉的混合總RNA為模版，合成eDNA第一鏈。正向外側(cè)引物BnG6PDHI-F1：5’-ATCTTGGTG-GATGGACTCGGGTT-3’，正向內(nèi)側(cè)引物BnG6PDHI-F2：5’-CTATTTGGGGAAGGAGTTGGTGC-3’，反向外側(cè)引物QO：5’-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3’，反向內(nèi)側(cè)引物QI：5’-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3’，接頭引物QT：5’-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAACTTTTTTTTTT-3’。3'端PCR擴(kuò)增：采用巢式PCR擴(kuò)增方式，進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增。第一輪擴(kuò)增以第一鏈eDNA為模版，以BnG6PDHI-F1和Q0為上下游引物，第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍后作為第二輪擴(kuò)增的模版。PCR反應(yīng)體系：10xBuffer2.5μul，第一鏈cDNA1.0μl、上下游引物（10μmol/L）各1.0μul、dNTP（2.5μumol/L）2.0μl、TransTaq-TDNAPolymerase0.2μl，滅菌水17.3μl。反應(yīng)程序：94C預(yù)變性2min;94C變性30s，65/60C退火30s、72C延伸90s，共32個循環(huán)，72C延伸7min，反應(yīng)終止于4C保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的條帶，將回收產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定后，送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.5 BnG6PDHl基因的開放讀碼框PCR驗證

用DNAMAN8軟件將獲得的3'端序列與原有序列進(jìn)行拼接，得到含有開放讀碼框的BnG6PDHl基因eDNA序列，為驗證序列的可靠性，在其開放讀碼框兩側(cè)設(shè)計一對正反向特異引物（BnG6PDHI-F：5’-TTGGAGAAACTTGTGGAGATTAGAAGATGG-3’，BnG6PDHI-R：5’-CACGCCACACAACATGCTTATTC-CG-3’），以中苧一號的根、莖、葉混合eDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物并連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans-T1，經(jīng)PCR鑒定后送陽性克隆測序。

1.6 BnG6PDHl基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫的ORF Finder程序（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/offinder/）查找BnG6PDHl基因的開放讀碼框，并對核苷酸序列進(jìn)行翻譯;采用ExPASy網(wǎng)站的ProtParam程序（https：//www.ex-pasyorg/）對BnG6PDH1蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析;利用PRABI網(wǎng)站的SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibep.fr）對BnG6PDHl蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測;利用SignalP4.1Server（htp：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）程序預(yù)測BnG6PDH1蛋白的信號肽序列;利用TMHMMServerv2.0軟件（htp：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）對BnG6PDH1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測;利用WoLFPSORT軟件（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）對BnG6PDH1蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測;通過NCBI數(shù)據(jù)庫的CDsearch程序（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和Ex-PASy數(shù)據(jù)庫的PROSITE程序（https：//prosite.ex-pasy.org/）對BnG6PDH1蛋白的保守功能域進(jìn)行預(yù)測;利用NCBI的BLAST程序（http：//blast.nebi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行BnG6PDH1蛋白的同源性比對分析;BnG6PDH1與其他植物物種G6PDH蛋白的多重比對分析用DNAMAN8軟件完成;系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建利用MEGA5.0軟件完成，采用Neighbor-Joining方法進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，1000次bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗。

1.7 BnG6PDHl基因的表達(dá)分析

根據(jù)BnG6PDHl基因的eDNA序列設(shè)計實時熒光定量PCR（RT-qPCR）引物（BnG6PDHI-QF：5’-TGAGCTAAAACCGCTTCCATACA-3’，BnG6PDHI-QR：5’-TTGAACATCCGACACGCCAC-3’），采用ABI公司的StepOnePlus Real-Time PCR System實時熒光定量PCR系統(tǒng)，分析苧麻根、莖葉中以及不同質(zhì)量濃度鎘脅迫下BnG6PDHI基因的表達(dá)情況。反應(yīng)體系：第一鏈eDNA模版1.0μl，上下游引物（10μmol/L）各0.8ul，SYBRPremixExTaqII10.0μl，ROXReferenceDye0.4μul，滅菌水7.0μl。反應(yīng)程序：95C預(yù)變性30s;95C5s，60°C30s，40個循環(huán)。每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。以苧麻Actin為內(nèi)參基因（BnActin-F：5'-GTTGAACCCTAAGGCTAACAGAG-3'，BnActin-R：5'-GGAATCCAGCACGATACCAG-3'），計算BnG6PDHI基因的相對表達(dá)量，數(shù)據(jù)分析按照2方法，采用StepOnePlus system和Excel2007軟件進(jìn)行。利用SPSS16.0軟件進(jìn)行相對表達(dá)量的差異顯著性分析（Duncan's法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 BnG6PDHl基因全長cDNA的克隆

提取營養(yǎng)生長期的苧麻根、莖、葉的總RNA，等量混合后反轉(zhuǎn)錄為eDNA模版，采用RACE方法獲得大小為1119bp的3'RCAEPCR產(chǎn)物，用DNA-MAN8.0軟件將其與已知Unigene片段進(jìn)行拼接，得到大小為1872bp的eDNA序列。為進(jìn)一步驗證序列的可靠性，在開放讀碼框兩側(cè)設(shè)計特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條大小為1805bp的特異擴(kuò)增條帶（圖1），測序驗證了讀碼框序列的準(zhǔn)確性。GenBank數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果表明，該基因與已登錄的其他植物的胞質(zhì)型G6PDH的相似性較高，將其命名為BnG6PDHl，GenBank登錄號為MG941010。

2.2 BnG6PDHl基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫的ORFfinder軟件對獲得的序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明BnG6PDHl基因5'端非編碼區(qū)的長度為102bp，3'端非編碼區(qū)的長度為216bp，開放讀碼框長度為1554bp，終止密碼子為TAG，含有34bp的PolyA序列，編碼517個氨基酸（圖2）。應(yīng)用ExPASy網(wǎng)站的ProtParam程序?qū)nG6PDHl基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)的分子量為59250，等電點為5.92，含有20種氨基酸，其中Leu（11.4%）含量最高，Cys含量最低（0.8%），分子式為C263+H1570o.S.利用PRABI網(wǎng)站的SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibep.fr）對BnG6PDH1蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，推測該蛋白質(zhì)主要由a螺旋（a-helix）、無規(guī)則卷曲（Randomcoil）和延伸鏈（Extendedstrand）結(jié)構(gòu)組成，比例分別為39.65%、43.13%和17.21%。

SignalP4.1Server軟件分析結(jié)果表明，BnG6PDH1蛋白不含信號肽序列，不屬于分泌型蛋白。利用TMHMM Serverv2.0軟件預(yù)測BnG6PDH1的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，BnG6PDH1蛋白不存在跨膜區(qū)域。利用WoLFPSORT軟件對BnG6PDH1的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明BnG6PDH1蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中。

利用DNAMAN8軟件對苧麻BnG6PDH1蛋白和其他植物物種的G6PDH進(jìn)行多序列比對（圖3）發(fā)現(xiàn)，苧麻BnG6PDH1與川桑、棗、甜櫻桃、蘋果和梅的胞質(zhì)型G6PDH蛋白的相似性較高，相似度分別為92%、91%、89%、88%和88%。利用NCBI的CD-search和ExPASy數(shù)據(jù)庫的PROSITE分析氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)BnG6PDH1蛋白的35～223位氨基酸屬于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的NAD結(jié)合區(qū)域，227～503位氨基酸為該酶的C端保守結(jié)構(gòu)域，213～219位氨基酸序列為G6PDH蛋白保守的DHYLGKE活性位點。

利用MEGA 5.0軟件將苧麻BnG6PDH1與其他植物的G6PDH蛋白進(jìn)行多重比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。結(jié)果表明，來源于不同植物的G6PDH蛋白可被聚類為兩大類。其中，一類為質(zhì)體型G6PDH蛋白，該類G6PDH的N端含有信號肽，主要定位于細(xì)胞質(zhì)體當(dāng)中;另一類為胞質(zhì)型G6PDH蛋白，該類蛋白不含信號肽，主要位于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，苧麻BnG6PDH1與胞質(zhì)型G6PDH蛋白聚為一類，其中苧麻BnG6PDH1與川桑G6PDH蛋白的親緣關(guān)系最近。

2.3 苧麻BnG6PDHl基因的表達(dá)分析

為研究BnG6PDHl基因在苧麻不同組織中的表達(dá)特性，提取苧麻根、莖、葉的總RNA，以苧麻Actin基因為內(nèi)參基因，利用熒光定量PCR對BnG6PDHl基因在苧麻不同組織中的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，BnG6PDHI基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性，其在苧麻葉中的表達(dá)量最高，其次為莖，根部的表達(dá)量最低，葉和莖中BnG6PDHl基因的表達(dá)量分別為根部的8.75倍和2.83倍，差異達(dá)到顯著水平（圖5）。

為研究苧麻BnG6PDHl基因在鎘脅迫條件下的表達(dá)特性，采用不同濃度的Cd對苧麻幼苗進(jìn)行處理，提取葉片總RNA，以苧麻Actin基因為內(nèi)參基因，利用熒光定量PCR對BnG6PDHl基因在不同質(zhì)量濃度鎘脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果（圖6）表明，苧麻BnG6PDHl基因的表達(dá)受鎘脅迫的誘導(dǎo)，隨著鎘質(zhì)量濃度的增加，BnG6PDHl基因的表達(dá)量逐步增加，當(dāng)Cd質(zhì)量濃度增加到100mg/L時，BnG6PDHl基因的表達(dá)量達(dá)到最大，為對照的5.15倍;當(dāng)Cd質(zhì)量濃度繼續(xù)增加到150mg/L時，BnG6PDHl的表達(dá)量略有下降，為對照的4.62倍。

3 討論

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶是磷酸戊糖代謝途徑的關(guān)鍵限速酶，調(diào)控NADPH和碳流的產(chǎn)生G6PDH催化生成的NADPH不僅為生物細(xì)胞中一些生物大分子的生物合成提供所需的還原力，同時還是與抗氧化及解毒有關(guān)的還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）再生的唯一還原力，可見G6PDH在植物生長發(fā)育過程中起到至關(guān)重要的作用。本研究從苧麻品種中苧一號中成功克隆了BnG6PDHI基因的完整開放讀碼框。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，在推導(dǎo)的氨基酸序列中，35～223位氨基酸屬于G6PDH蛋白的NAD結(jié)合區(qū)域，227～503位氨基酸為G6PDH蛋白的C端保守結(jié)構(gòu)域，213～219位氨基酸序列為G6PDH蛋白保守的DHYLGKE活性位點，以上結(jié)果表明它是一個典型的G6PDH蛋白。

植物體內(nèi)同時存在胞質(zhì)和質(zhì)體氧化戊糖磷酸途徑，即植物細(xì)胞中的G6PDH同工酶可分為胞質(zhì)型和質(zhì)體型2種類型，胞質(zhì)型G6PDH的氨基酸序列比質(zhì)體G6PDH少一段約60個氨基酸左右的轉(zhuǎn)運肽序列。這2種類型的G6PDH在調(diào)節(jié)方式上有所不同，胞質(zhì)G6PDH受到代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)，而質(zhì)體G6PDH只有在夜晚才具有活性。目前，在不同植物中發(fā)現(xiàn)了多種類型的G6PDH同工酶，比如擬南芥中發(fā)現(xiàn)的6個G6PDH蛋白中，有4種為質(zhì)體型，2種為胞質(zhì)類型。本研究中，對苧麻BnG6PDH1蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，BnG6PDH1與其他植物的胞質(zhì)G6PDH蛋白相似性較高，不含質(zhì)體G6PDH所具有的信號肽序列，也不存在跨膜區(qū)域。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，BnG6PDH1蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，BnG6PDH1蛋白與胞質(zhì)類G6PDH親緣關(guān)系較近。因此，綜合以上結(jié)果可以推測，苧麻BnG6PDH1為胞質(zhì)型蛋白。

一些研究結(jié)果表明，G6PDH基因的表達(dá)存在組織特異性。王曉暉等[38]研究發(fā)現(xiàn)，臘梅G6PDHI基因主要在花和根中表達(dá)，在葉和莖中表達(dá)量較低。侯夫云利用半定量RT-PCR分析了水稻胞質(zhì)型0sG6PDHl基因在水稻根、莖、葉和幼穗中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsG6PDHI在根、莖和穗中呈高豐度表達(dá)，而在葉中的表達(dá)量較低。本研究中，苧麻BnG6PDHI基因在葉中表達(dá)量最高，而在根中表達(dá)量最低。這表明G6PDH在不同植物中的表達(dá)存在差異，推測BnG6PDHl基因主要在苧麻的葉片生長發(fā)育和防御機(jī)制中起作用。

大量研究結(jié)果表明，外界的一些生物或非生物脅迫能夠誘導(dǎo)植物G6PDH的表達(dá)，包括重金屬脅迫。Van等研究發(fā)現(xiàn)，菜豆在鋅或鎘離子刺激后，G6PDH及其他酶的活性也被誘導(dǎo)，因而認(rèn)為G6PDH等酶可作為土壤是否受到鋅或鎘離子污染的檢測指標(biāo)。李焱對大豆的研究結(jié)果表明，高質(zhì)量濃度的鋁脅迫可以誘發(fā)大豆胞質(zhì)型G6PDH蛋白活性的增加，2個編碼胞質(zhì)G6PDH蛋白的基因G6PDHl和G6PDH2在鋁脅迫下也能夠被顯著地誘導(dǎo)表達(dá)。錢立生等采用不同質(zhì)量濃度的鎳處理小麥幼苗并測定根系抗氧化酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小麥G6PDH的活性隨著鎳處理質(zhì)量濃度的提高而逐漸提高。本研究中，苧麻BnG6PDHI基因的表達(dá)顯著受鎘的誘導(dǎo)，表達(dá)量隨鎘質(zhì)量濃度的增加而增加，暗示BnG6PDHI基因可能在苧麻鎘耐受機(jī)制中具有重要功能，這一結(jié)論將為后續(xù)苧麻耐鎘生理及分子機(jī)制研究提供線索和思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐奕，梁學(xué)峰，彭亮，等.農(nóng)田土壤重金屬污染黏土礦物鈍

化修復(fù)研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，49（2）：156-162，167.

[2]陳懷滿.土壤植物系統(tǒng)中的重金屬污染[M].北京：北京出版社，2005.

[3]公勤，康群，王玲，等.重金屬銅對植物毒害機(jī)理的研究現(xiàn)狀及展望[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，49（3）：469-475.

[4]劉晨，賈鳳安，呂睿.我國耕地重金屬污染現(xiàn)狀及固氮菌在其修復(fù)中的作用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（3）：21-27.

[5]CHRISTENSENTH.Cadmiumsoilsorptionatlowconcentrations：V.Evidenceofcompetitionbyotherheavymetals[J].WaterAirandSoilPollution，1987，34（3）：293-303.

[6]TOPPILSD，GABBRIELLIR.Responsetocadmiuminhigherplants[J].EnvironmentalandExperimentalBotany，1999，41（2）：105-130.

[7]CHANEYRL，REEVESPG，RYANJA，etal.AnimprovedunderstandingofsoilCdrisktohumansandlowcostmethodstophytoextractCdfromcontaminatedsoilstopreventsoilCdrisks[J].Biometals，2004，17（5）：549-553.

[8]SHAHK，NONGKYNRIHJM.Metalhyperaccumulationandbioremediation[J].BiologiaPlantarum，2007，51（4）：618-634.

[9]BOWSHERCG，HUCKLESBYDP，EMESMJ.NitritereductionandcarbohydratemetabolisminplastidspurifiedfromrootsofPisumsativumL.[J].Planta，1989，177（3）：359-366.

[10]ESPOSITOS，MASSAROG，VONAV，etal.Glutamatesynthesisinbarleyroots：theroleoftheplastidieglucose-6-phosphatedehy-drogenase[J].Planta，2003，216（4）：639-647.

[11]HUTCHINGSD，RAWSTHORNES，EMESMJ.Fattyacidsynthesisandtheoxidativepentosephosphatepathwayindevelopingembryosofoilseedrape（BrassicanapusL.）[J].JournalofExper-imentalBotany，2005，56（412）：577-585.

[12]LINYZ，ZHANGZY，LINSZ，etal.Highlevelexpressionofglucose-6-phosphatedehydrogenasegenePsG6PDHfromPopulussuaveolensinE.coli[J].ForestEcosystems，2005，7（3）：35-38.

[13]GRAEVEK，SCHAEWENA，SCHEIBER.Purification，characterization，andcDNAsequenceofglucose-6-phosphatedehydro-genasefrompotato（SolanumtuberosumL.）[J].ThePlantJour-nal，1994，5（3）：353-361.

[14]WAKAOS，BENNINGC.Genome-wideanalysisofglucose-6-phosphatedehydrogenasesinArabidopsis[J].PlantJournal，2005，41（2）：243-256.

[15]NEMOTOY，SASAKUMAT.Specificexpressionofglucose-6-phosphatedehydrogenase（G6PDH）genebysaltstressinwheat（TriticumaestiwumL.）[J].PlantScience，2000，158（2）：53-61.

[16]KNIGHTJS，EMESMJ，DEBNAMPM.Isolationandcharacter-isationofafull-lengthgenomiccloneencodingaplastidicglucose-6-phosphatedehydrogenasefromNicotianatabacum[J].Planta，2001，212（4）：499-507.

[17]FAHRENDORFT，NIW，SHORROSHBs，etal.Stressresponsesinalfalfa（MedicagosativaL.）XIX.Transcriptionalactivationofoxidativepentosephosphatepathwaygenesattheonsetoftheisoflavonoidphytoalexinresponse[J].PlantMolecularBiology，1995，28（5）：885-900.

[18]SCHARTEJ，SCHONH，TJADENZ，etal.Isoenzymereplacementofglucose-6-phosphatedehydrogenaseinthecytosolimprovesstresstoleranceinplants[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2009，106（19）：8061-8066.

[19]WANGH，YANGL，LIY，etal.InvolvementofABAandH202dependentcytosolicglucose-6-phosphatedehydrogenaseinmaintai-ningredoxhomeostasisinsoybeanrootsunderdroughtstress[J].PlantPhysiologyandBiochemistry，2016，107：126- 136.

[20]林元震，張志毅，郭海，等.甜楊PsG6PDH基因超表達(dá)對提高煙草抗寒凍性的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，38（3）：125-131.

[21]CARRERASA.ThedehydrogenasemediatedrecyclingofNADPHisakeyantioxidantsystemagainstsalt-inducedoxidativestressinoliveplants[J].PlantCellandEnvironment，2006，29（7）：1449- 1459.

[22]DEBNAMPM，F(xiàn)ERNIEAR，LEISSEA，etal.AlteredactivityoftheP2isoformofplastidicglucose6-phosphatedehydrogenaseintobacco（Nicotianatabacumcv.Samsun）causeschangesincarbo-hydratemetabolismandresponsetooxidativestressinleaves[J].PlantJournal，2004，38（1）：49-59.

[23]SLASKIJJ，ZHANGGC，BASUU，etal.Aluminumresistanceinwheat（Triticumaestivum）isassociatedwithrapid，Al-inducedchangesinactivitiesofglucose-6-phosphatedehydrogenaseand6-phosphogluconatedehydrogenaseinrootapices[J].PhysiologiaPlantarum，1996，98（3）：477-484.

[24]LINSZ，ZHANGZY，LIUWF，etal.Roleofglucose -6-phos-phatedehydrogenaseinfreezing -inducedfreezingresistanceofPop-ulussuaveolens[J].ActaPhotophysiologicaSinica，2005，31（1）：34-40.

[25]LIUJ，WANGXM，HUYF，etal.Glucose-6-phosphatedehydrogenaseplaysapivotalroleintolerancetodroughtstressinsoy-beanroots[J].PlantCellReports，2013，32（3）：415-429.

[26]SINDELARL，SINDELAROVAM，BURKETOVAL.Changesinactivityofglucose-6-phosphateand6-phosphogluconatedehydro-genaseisozymesuponpotatovirusYinfectionintobaccoleaftis-suesandIprotoplasts[J].PlantPhysiologyandBiochemistry，1999，37（3）：195-201.

[27]李宗道.麻作的理論與技術(shù)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1980：124-256.

[28]雷梅，岳慶玲，陳同斌，等.湖南柿竹園礦區(qū)土壤重金屬含量及植物吸收特征[J].生態(tài)學(xué)報，2005，25（5）：1146-1151.[29]曹德菊，周世杯，項劍.苧麻對土壤中鎘的耐受和積累效應(yīng)研究[J].中國麻業(yè)科學(xué)，2004，26（6）：272-274.

[30]朱守晶，史文娟，揭雨成.不同苧麻品種對土壤中鎘、鉛富集的差異[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，34（2）：320-326.

[31]佘瑋，揭雨成，邢虎成，等.湖南石門、冷水江、瀏陽3個礦區(qū)的苧麻重金屬含量及累積特征[J].生態(tài)學(xué)報，2011，31（3）：874-881.

[32]朱守晶，余偉林，石朝燕，等.苧麻谷胱甘肽還原酶基因（BnGR1）的克隆和表達(dá)分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2015，23（10）：1318-1326.

[33]SHEW，ZHUSJ，JIEYC，etal.Expressionprofilingofcadmiumresponsegenesinramie（BoehmerianiveaL.）root[J].Bulle-tinofEnvironmentalContaminationandToxicology，2015，94（4）：453-459.

[34]GEIGENBERGERP，KOLBEA，TIESSENA.Redoxregulationofcarbonstorageandpartitioninginresponsetolightandsugars[J].JExpBot，2005，56（416）：1469-1479.

[35]ZHANGZ，LIEWCW，HANDYDE，etal.Highglucoseinhibitsglucose-6-phosphatedehydrogenase，leadingtoincreasedoxida-tivestressandbeta-cellapoptosis[J].FasebJournal，2010，24（5）：1497.

[36]DENNISDT，MIERNYKJA.Compartmentationofnonphotosyn-theticcarbohydratemetabolism[J].AnnualReviewofPlantPhysi-ology，1982，33（1）：27-50.

[37]SAKAIA，RCHERW.Frostsurvivalofplantsresponsesandadaptationtofreezingstress[M].NewYork：SpringerVerlag，1987：210-222.

[38]王曉暉，劉曉，高博聞，等.臘梅葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDHI）基因的克隆及表達(dá)分析[J].中國中藥雜志，2015，40（21）：4160-4164.

[39]侯夫云.水稻戊糖磷酸途徑兩個關(guān)鍵酶基因的克隆與功能分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[40]VANAF，CARDINAELSC，CLIJSTERSH.Inductionofenzymecapacityinplantsasaresultofheavymetaltoxicity：dose-responserelationsinPhaseolusvulgarisL.treatedwithzincandcadmium[J].EnvironmentalPollution，1988，52（2）：103-115.

[41]李焱.NO和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在大豆鋁脅迫響應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用研究[D].新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)，2017.

[42]錢立生，王松華，何慶元.小麥幼苗根系抗氧化酶對鎳脅迫的響應(yīng)[J].核農(nóng)學(xué)報，2014，28（9）：1708-1714.