王莉　王青　隨瑞枝　宋旭梅　馬菊梅　劉燕翔　張翠霞　芮淑賢

[摘要]目的：探討產(chǎn)前篩查濾紙干血片標(biāo)本保存時(shí)間和保存條件對(duì)AFP、Freeβ-HCG檢測(cè)結(jié)果的影響。方法：采集50例孕婦血樣，每例均制備兩份濾紙干血片標(biāo)本，每一份上面包括3個(gè)血斑。一組29C～8C冷藏;另一組室溫20°C～25°C保存。分別在保存第2d、7d、14d時(shí)，用TALENT-II半自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀檢測(cè)AFP、Freeβ-HCG。結(jié)果：室溫組和冷藏組在2d、7d、14dAFP和Freeβ-HCG檢測(cè)結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AFP和Freeβ-HCG冷藏組在2d、7d、14d的結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AFP和Freeβ-HCG室溫組在2d、7d、14d的結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：濾紙干血片標(biāo)本在冷藏2°C～8C、室溫20°C～25°C均可穩(wěn)定保存至14d。開展篩查時(shí)應(yīng)注重標(biāo)本保存條件和運(yùn)輸時(shí)間，確保標(biāo)本質(zhì)量和篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[關(guān)鍵詞]濾紙干血片法;產(chǎn)前篩查;時(shí)間;溫度

中圖分類號(hào)：R394

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-5200（2019）02-041-04

DOI：10.11876/mimt201902011

中孕期唐氏綜合征（DS）血清學(xué)產(chǎn)前篩查的常用標(biāo)志物包括甲胎蛋白（AFP）.游離β人類絨毛膜促性腺激素（Freeβ-HCG）、游離雌三醇（uE3）和抑制素A（InhA）。血清標(biāo)本應(yīng)在49C～8C保存，不超過7d"。AFP為相對(duì)穩(wěn)定的蛋白類物質(zhì)，HCG相對(duì)不穩(wěn)定，血清標(biāo)本靜置的時(shí)間和溫度（室溫、37C）對(duì)結(jié)果影響很大。分離后的血清在49C～8C條件下可穩(wěn)定保存1周，遠(yuǎn)距離運(yùn)輸時(shí)應(yīng)有冷鏈系統(tǒng)，保證保存環(huán)境B。產(chǎn)前篩查機(jī)構(gòu)和采血機(jī)構(gòu)不在同一醫(yī)療機(jī)構(gòu)時(shí)，需要先分離出血清再保存、運(yùn)送，運(yùn)輸距離和保存條件不達(dá)標(biāo)導(dǎo)致邊遠(yuǎn)地區(qū)的孕婦不能進(jìn)行產(chǎn)前篩查，影響了產(chǎn)前篩查的大規(guī)模開展。干血斑法最早于1963年首次用于代謝性疾病的大規(guī)模篩查，后應(yīng)用于新生兒疾病的篩查。其具有成本低廉、血樣采集方法簡(jiǎn)單、減少溶血和樣本降解、不需要離心、在高溫情況下穩(wěn)定、減少了運(yùn)輸和儲(chǔ)存費(fèi)用等優(yōu)勢(shì)。濾紙干血片技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前篩查領(lǐng)域是一項(xiàng)比較新的技術(shù)。已有文獻(xiàn)報(bào)道顯示同一孕婦血清學(xué)法和干血片法兩種檢測(cè)方法有很好的相關(guān)性，檢測(cè)AFP、Freeβ-HCG結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示血清法和濾紙干血片兩種方法有很好一致性。

為確保檢驗(yàn)前標(biāo)本質(zhì)量及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，就有必要對(duì)產(chǎn)前篩查濾紙干血片標(biāo)本的保存時(shí)間及保存條件對(duì)AFP和Freeβ-HCG含量影響進(jìn)行探討。相比已有報(bào)道，本研究延長(zhǎng)了保存時(shí)間、擴(kuò)大了保存溫度范圍，進(jìn)一步研究時(shí)間和溫度對(duì)標(biāo)本的影響。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

50例孕15+6～20*周中孕期孕婦，單胎，取得其產(chǎn)前篩查的知情同意后，進(jìn)行血清學(xué)唐氏篩查時(shí)同時(shí)制備干血片標(biāo)本。

1.2濾紙干血片法儀器和試劑

TALENT-II半自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀;FWZ-I型微量振蕩器;DEM-3自動(dòng)洗板機(jī);打孔器;配套試劑AFP試劑盒（批號(hào)：20160706）;Freeβ-HCG試劑盒（批號(hào)：20160706）。

1.3標(biāo)本采集

每例孕婦采集1管靜脈血液標(biāo)本，采集標(biāo)本的容器為干燥真空采血管、不含任何添加劑，采樣量為3～5mL。采集后，每份靜脈血標(biāo)本再用移液器吸取制備兩份濾紙干血片標(biāo)本（注：每一份上面包括3個(gè)血斑。制備過程需快，以防血液凝集。每個(gè)血斑血量50uL，直徑8mm，兩面滲透，無重疊，室溫干燥2h后，將兩份分別放人兩個(gè)干燥避光密封袋內(nèi)。實(shí)驗(yàn)濾紙片采用廣州豐華生物科技有限公司提供的產(chǎn)前篩查采血卡），剩余i血液3000r/min，離心10min，分離血清，2°C～8°C保存待檢測(cè)。

1.4分組檢測(cè)

按不同的保存條件分為冷藏組、室溫組。將濾紙干血片標(biāo)本放入干燥避光密封袋內(nèi)，一組2°～8C冷藏;另一組室溫20°C～25C保存。分別在保存第2d、7d、14d時(shí)，用TALENT-II半自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀采用DELFIA法檢測(cè)AFP、Freeβ-HCG。

1.5統(tǒng)計(jì)方法

分析軟件SPSS22.0軟件包，相同保存時(shí)間不同保存條件樣本檢測(cè)結(jié)果比較，采用t檢驗(yàn);相同保存條件不同保存時(shí)間樣本檢測(cè)結(jié)果比較，采用F檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同保存條件對(duì)干血片中AFP、Freeβ-HCG含量的影響

室溫組和冷藏組在2d、7d、14dAFP和Freeβ-HCG檢測(cè)結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2保存天數(shù)對(duì)干血片中AFP、Freeβ-HCG含量的影響

如表2所示，AFP冷藏組在2d、7d、14d的結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn)，F(xiàn)=1.894，P=0.155>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AFP室溫組在2d、7d、14d的結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn)，F(xiàn)=1.184，P=0.310>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即室溫保存和29C～8C保存未發(fā)現(xiàn)干血片中AFP含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)檢測(cè)值發(fā)生顯著變化。

如表3所示，F(xiàn)reeβ-HCG冷藏組在2d、7d、14d的結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn)，F(xiàn)=0.516，P=0.598>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Freeβ-HCG室溫組在2d、7d、14d的結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn)，F(xiàn)=0.683，P=0.507>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即室溫保存和2°C～89C保存未發(fā)現(xiàn)干血片中Freeβ-HCG含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)檢測(cè)值發(fā)生顯著變化。

3討論

出生缺陷指嬰兒出生時(shí)就存在的身體結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常，是嚴(yán)重影響兒童體格生長(zhǎng)和智力發(fā)育的疾病。出生缺陷已成為世界上嬰兒死亡、兒童和成人殘疾的主要原因之一。在我國(guó)，出生缺陷已經(jīng)成為導(dǎo)致殘疾的重要原因，而最常見的出生缺陷疾病為唐氏綜合征（Downsyndrome，DS）、愛德華綜合征（Edwardssyndrome，ES）、開放性神經(jīng)管缺陷（openneuraltubedefect，ONTD）3種，這三種出生缺陷病均可在孕中期產(chǎn)檢時(shí)進(jìn)行篩查和診斷。迄今為止，染色體異常還沒有有效的治療手段。提高產(chǎn)前篩查檢測(cè)質(zhì)量，擴(kuò)大產(chǎn)前篩查覆蓋的區(qū)域，降低DS等疾病嬰兒出生率是所有地區(qū)衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和檢測(cè)機(jī)構(gòu)最關(guān)注的問題。濾紙干血片標(biāo)本用于產(chǎn)前篩查生物安全性高，標(biāo)本易保存、易運(yùn)送、方便快捷，更適合大規(guī)模開展篩查工作。

干血片有便于采集、便于轉(zhuǎn)運(yùn)、經(jīng)濟(jì)適用、易于保存等優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)外，廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)，流行病學(xué)及新生兒篩查等。國(guó)內(nèi)可以成功建立起新生兒疾病篩查方法和系統(tǒng)，也正是充分利用了干血片標(biāo)本的這些優(yōu)點(diǎn)。

文獻(xiàn)報(bào)道AFP、Freeβ-HCG干血片法檢測(cè)結(jié)果在（18C+1C）48h內(nèi)檢測(cè)結(jié)果無顯著差異[10。也有報(bào)道AFP濾紙干血片在-20C、4°C、25C下均可保存28d，但在35°C下最長(zhǎng)可以保存12d;Freeβ-HCG濾紙干血片在-20C及49C下均可保存28d，室溫下可保存6d，35°C下最長(zhǎng)可以保存3d179.161。還有文獻(xiàn)報(bào)道Freeβ-HCG及AFP在血片中置4C條件下保存至少可穩(wěn)定60d。AFP血片密封保存于4C時(shí)可以保存半年，室溫環(huán)境37°C下可穩(wěn)定保存1個(gè)月。Freeβ-HCG血片密封保存，常溫下保存35d其檢測(cè)水平變化在10%以內(nèi)，4°C可以保持。綜合以上文獻(xiàn)，F(xiàn)reeβ-HCG在高溫35C以上不穩(wěn)定，影響了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

結(jié)合本地區(qū)特點(diǎn)，本研究選取了209C～25°C作為室溫保存條件，結(jié)果顯示：室溫組與冷藏組相同保存時(shí)間檢測(cè)結(jié)果比較，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。標(biāo)本中分析物在室溫（20°～25C）和冷藏（2C～8C）均穩(wěn)定保存。不同保存時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果比較，分析物AFP和Freeβ-HCG含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果未發(fā)生顯著變化。濾紙干血片標(biāo)本AFP、Freeβ-HCG在2C～8C、室溫約20～25C均可穩(wěn)定保存至少14d，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符。本研究結(jié)果有一定局限性，主要是由于實(shí)驗(yàn)室室溫相對(duì)恒定，因此產(chǎn)生局限性。

與血清相比，濾紙干血片法分析物在血片中更穩(wěn)定，不易受環(huán)境溫度和保存時(shí)間的影響。但在大規(guī)模產(chǎn)前篩查中可能會(huì)出現(xiàn)各種未知因素影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，標(biāo)本的運(yùn)輸和保存仍是分析前質(zhì)量管理最關(guān)鍵的步驟，各基層采血機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制。濾紙干血片用于產(chǎn)前篩查，低溫保存和運(yùn)輸最為可靠，當(dāng)不能滿足低溫保存時(shí)，應(yīng)當(dāng)盡可能將運(yùn)輸環(huán)境溫度維持在25C以下，盡快將采集好的干血片標(biāo)本送至檢測(cè)機(jī)構(gòu)，以確保檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量，減少因檢驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確導(dǎo)致的漏診。對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，需充分告知其知情，進(jìn)行胎兒羊水細(xì)胞核型分析，及時(shí)發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常，結(jié)合分子檢測(cè)、細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，降低出生缺陷，提高出生嬰兒的健康水平。

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