白 玲 李 倩 鄧 蕓 黃振興 謝利娟 阮文權(quán)

(1.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院， 無(wú)錫 214122； 2.江蘇省厭氧生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無(wú)錫 214122)

0 引言

隨著沼氣工程的快速發(fā)展，厭氧發(fā)酵技術(shù)已廣泛應(yīng)用于處理各種有機(jī)廢棄物，但是產(chǎn)生大量的沼渣亟需處理。污泥沼渣和秸稈沼渣分別是城市污水處理廠污泥和稻秸經(jīng)過(guò)厭氧發(fā)酵后的渣滓，可能含有病原微生物和氨氧化物質(zhì)等污染物；醋糟是玉米、高粱等與大量麩皮和稻殼等添加物進(jìn)行醋酸發(fā)酵后的剩余物，含有大量木質(zhì)纖維等不可分解物質(zhì)，影響其利用效率[1]。這些沼渣中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有益微生物，可用作肥料或土壤改良劑，但是直接施用可能會(huì)給土壤和水帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)。堆肥被認(rèn)為是循環(huán)再利用有機(jī)廢棄物的有效方法之一，且可產(chǎn)生安全穩(wěn)定的堆肥產(chǎn)品[2]。但有學(xué)者指出沼渣中可降解物質(zhì)含量較低，不適宜單獨(dú)堆肥[3-4]，聯(lián)合餐廚廢棄物和牛糞進(jìn)行混合堆肥可彌補(bǔ)沼渣單獨(dú)堆肥的缺陷。

堆肥過(guò)程是有機(jī)物質(zhì)在多種微生物及其分泌的酶共同作用下，發(fā)生礦化和腐殖化作用，轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的腐殖質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，堆肥的質(zhì)量也與其穩(wěn)定性存在顯著相關(guān)性[5]。礦化過(guò)程主要是在水解酶作用下進(jìn)行，而腐殖化過(guò)程則是在氧化還原酶作用下進(jìn)行[6]，因此，堆肥過(guò)程中酶活性的變化可反映堆肥的腐殖化程度。腐殖化過(guò)程也是小分子有機(jī)物逐漸形成大分子腐殖質(zhì)類(lèi)物質(zhì)過(guò)程。研究表明，在堆肥過(guò)程中微生物可以利用富里酸作為能源物質(zhì)形成更加穩(wěn)定的胡敏酸[7-8]，增加腐殖質(zhì)中胡敏酸的含量[9]，從而加速堆肥的腐熟。目前對(duì)于堆肥過(guò)程腐殖化研究較多[8, 10-12]，沼渣堆肥的研究也主要集中在禽畜糞便的沼渣[3, 13-15]，而對(duì)于其他沼渣堆肥腐殖化過(guò)程腐殖酸的分子量及腐殖化特征變化研究較少。本文分別以污泥沼渣、秸稈沼渣和醋糟為主原料，與餐廚廢棄物和牛糞聯(lián)合進(jìn)行堆肥，探究其堆肥過(guò)程中脫氫酶、纖維素酶、過(guò)氧化氫酶和多酚氧化酶活性的變化及腐殖化特征，為沼渣的高效資源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

污泥沼渣取自無(wú)錫新城污水處理廠厭氧發(fā)酵、壓濾后污泥；秸稈厭氧沼渣取自江蘇省厭氧生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行的厭氧反應(yīng)器中；醋糟取自江蘇省某食醋生產(chǎn)企業(yè)；餐廚廢棄物取自江南大學(xué)食堂；牛糞和秸稈取自江蘇省某農(nóng)場(chǎng)，其基礎(chǔ)理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 堆肥原材料基礎(chǔ)理化性質(zhì)Tab.1 Physicochemical characteristics of different raw materials for composting

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)采用模擬堆肥，在江蘇省厭氧生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。設(shè)置污泥沼渣(Sludge residue, SLR)、秸稈沼渣(Straw residue, STR)、醋糟(Vinegar residue, VR)為主要原料的3組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。混合物料初始碳氮比約為25，含水率為60%～70%，其中SLR組沼渣、餐廚廢棄物、牛糞、秸稈干質(zhì)量比為13∶3∶3∶6，STR和VR組相應(yīng)值為13∶3.25∶3.25∶3.25和13∶3∶3∶1。將混合物料混合均勻后裝入體積為5 L的泡沫箱中，整個(gè)堆肥發(fā)酵周期為30 d，采用翻堆方式進(jìn)行通風(fēng)。在堆肥前10 d，每2 d翻堆一次，以保證足夠的通氣量，在11～30 d，每5 d翻堆一次。每6 d取一次樣品，采用多點(diǎn)法取樣，混合均勻后分為兩部分，一部分保存在4℃冰箱中，用于酶活性、溶解性有機(jī)物(DOM)含量的測(cè)定；另一部分在陰涼通風(fēng)處風(fēng)干后，磨碎，過(guò)1 mm篩，用于腐殖質(zhì)各組分及分子量的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1酶活性的測(cè)定

脫氫酶活性采用氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法[16]；多酚氧化酶活性的測(cè)定采用鄰苯三酚比色法[17]；脲酶活性的測(cè)定采用靛酚藍(lán)比色法[17]；纖維素酶活性的測(cè)定采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)比色法[17]。

1.3.2腐殖質(zhì)各組分的提取與分析

稱(chēng)取2 g樣品于50 mL離心管中，加入40 mL 0.1 mol/L NaOH與0.1 mol/L Na4P2O7混合液，混合均勻后，在30℃ 150 r/min條件下振蕩24 h，靜置后5 000 r/min離心10 min，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，得到濾液，此為腐殖質(zhì)(HS)；取一定量濾液用6 mol/L HCl調(diào)至pH值至1，在4℃保存12 h，此時(shí)沉淀為胡敏酸(HA)，上清液為富里酸(FA)，慢速定性濾紙過(guò)濾后，用0.05 mol/L NaHCO3溶液溶解沉淀，富里酸(FA)利用差減法計(jì)算，各組分中TOC(總有機(jī)碳)含量利用TOC測(cè)定儀測(cè)定。

1.3.3腐殖質(zhì)分子量測(cè)定

采用高效凝膠色譜法(HPGFC)，色譜條件：色譜柱Ultrahydrogel TM Linear 300 mm×7.8 mm id×2；流動(dòng)相為0.1 mol/L硝酸鈉，流速為0.9 mL/min，柱溫為30℃。分子量校正曲線所用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(均購(gòu)置于Sigma公司)為：Dextran T-2000、Dextran T-150、Dextran T-40、Dextran T-10、Dextran T-5、葡萄糖180。

1.3.4熒光光譜測(cè)定

熒光光譜測(cè)定儀器為F-7000型熒光光度計(jì)(日本日立公司)。該儀器激發(fā)光源為150 W氙燈，PMT(光電倍增管)電壓400 V；響應(yīng)時(shí)間為自動(dòng)，掃描光譜進(jìn)行儀器自動(dòng)校正。三維熒光光譜掃描時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)為220～450 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為220～500 nm，掃描速度設(shè)定為2 400 nm/min，每個(gè)樣品TOC濃度調(diào)至10 mol/L。

1.3.5數(shù)據(jù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

腐殖化系數(shù)(Humification ratio,HR)計(jì)算公式為

(1)

式中S——腐殖質(zhì)碳質(zhì)量比,g/kg

T——總有機(jī)碳質(zhì)量比,g/kg

腐殖化指數(shù)(Humification index,HI)計(jì)算公式為

(2)

式中H——胡敏酸碳質(zhì)量比,g/kg

聚合程度(Degree of polymerization,DP)計(jì)算公式為

(3)

式中F——富里酸碳質(zhì)量比,g/kg

胡敏酸占有率(Percentage of HA，PHA)計(jì)算公式為

(4)

采用Excel 2016和Origin 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度和含水率

圖1 堆肥過(guò)程中溫度和含水率變化曲線Fig.1 Changes of temperature and moisture content during composting

在堆肥過(guò)程中，溫度的變化直接影響微生物的活性并決定有機(jī)物質(zhì)的穩(wěn)定性[18]。由圖1a可知，堆肥進(jìn)行第1天溫度逐漸升高，其中STR在第2 天就達(dá)到50℃，最高溫度出現(xiàn)在第4天(56℃)且高溫期(≥50℃)持續(xù)7 d；SLR在第7天達(dá)到50℃并維持3 d；VR分別在第2天和第16天出現(xiàn)高溫(50℃)但也僅維持1 d，隨后呈波動(dòng)性下降，這可能是由于醋糟顆粒較大，使得堆體的孔隙較大，導(dǎo)致熱量容易散失，到后期充足的氧氣和有機(jī)物質(zhì)使微生物活性增加，提高了堆肥溫度。STR有較長(zhǎng)時(shí)間的高溫期，可能是由于復(fù)雜有機(jī)成分降解為簡(jiǎn)單的小分子化合物供微生物利用造成堆肥過(guò)程中持續(xù)的高溫[19-20]，加速堆肥腐熟。堆肥前期出現(xiàn)的短期低溫現(xiàn)象是由翻堆所致，但不到1 d溫度會(huì)回升，這與MUKESH等[16]和AWASTHI等[21]研究結(jié)果一致。

含水率是堆肥過(guò)程中重要的指標(biāo)之一，水分為養(yǎng)分的運(yùn)輸和有機(jī)質(zhì)的降解提供介質(zhì)。堆肥過(guò)程中含水率的變化如圖1b所示。SLR、STR和VR的初始含水率分別為63.94%、65.32%和67.88%，隨著堆肥的進(jìn)行，含水率逐漸降低，這主要是由微生物活動(dòng)產(chǎn)生熱量導(dǎo)致水分蒸發(fā)所致。SLR在堆肥前6 d含水率增加，可能是由于部分有機(jī)物質(zhì)發(fā)生水解。到堆肥結(jié)束時(shí)，SLR的含水率較高，為47.45%，其次是STR，為37.01%，VR的含水率最低。在堆肥后期，堆體溫度已降低，水分的減少主要依靠翻堆或通氣。醋糟的顆粒較大，導(dǎo)致堆體的通氣性較好，保水性能較差，因此，在堆肥后期，與SLR相比，VR的含水率下降較快。

2.2 堆肥過(guò)程酶活性的變化

2.2.1脫氫酶和纖維素酶

脫氫酶直接參與微生物的呼吸作用，其活性可反映微生物對(duì)有機(jī)物降解能力和有機(jī)物腐殖化程度[22-23]。3組實(shí)驗(yàn)中脫氫酶活性變化均呈現(xiàn)先升高后逐漸降低的趨勢(shì)(圖2a、2b、2c)，且最高值均出現(xiàn)在堆肥的第6天(此時(shí)處在高溫階段)，分別為63.79、50.18、63.81 μg/(g·h)。在高溫期，微生物分泌大量脫氫酶以分解有機(jī)物質(zhì)為自身的生長(zhǎng)和繁殖提供營(yíng)養(yǎng)。堆肥結(jié)束時(shí)，SLR脫氫酶依然保持較高活性，為19.25 μg/(g·h)，說(shuō)明還存在部分不穩(wěn)定有機(jī)物；而STR和VR的脫氫酶活性較低，分別為4.45 μg/(g·h)和1.18 μg/(g·h)，表明大部分有機(jī)物質(zhì)已被微生物降解并轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的物質(zhì)，呼吸過(guò)程減慢[24]。由此說(shuō)明，STR和VR均已腐熟，而SLR還不穩(wěn)定。

纖維素酶與纖維素代謝有關(guān)，可將纖維素水解為葡萄糖等小分子化合物。如圖2d、2e、2f所示，在堆肥前12 d，3組實(shí)驗(yàn)的纖維素酶活性隨著堆肥時(shí)間逐漸降低，主要由于溫度開(kāi)始上升，微生物的代謝活力和水平處在較低狀態(tài)，此時(shí)微生物只利用簡(jiǎn)單易降解的小部分纖維素類(lèi)有機(jī)物，而體系中可被利用的有機(jī)物質(zhì)僅供微生物大量繁殖，無(wú)法刺激微生物大量產(chǎn)生酶類(lèi)等次生代謝產(chǎn)物。12 d后，SLR和 STR的纖維素酶活性逐漸增加，表明易降解有機(jī)物質(zhì)被消耗殆盡，微生物開(kāi)始利用大分子纖維素等有機(jī)物質(zhì)分解代謝，刺激微生物次生代謝，產(chǎn)生纖維素酶，使纖維素酶活性增加，與SLR相比，STR的纖維素酶活性較高，為5.06 mg/(g·d)；VR在12 d以后，纖維素酶活性先增加后降低，在第24天后又增加，主要由于堆肥體系中水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等減少，使微生物活性降低，次生代謝產(chǎn)物部分有累積。由此可見(jiàn)，在秸稈沼渣堆肥中更有利于纖維素的降解，從而使堆肥產(chǎn)品更穩(wěn)定。

圖2 堆肥過(guò)程中脫氫酶和纖維素酶活性變化Fig.2 Changes of dehydrogenase and cellulase activities during composting

2.2.2脲酶和多酚氧化酶

脲酶是一種與氮素循環(huán)有關(guān)的酶，可促進(jìn)脲素分子中的酰胺鍵水解，其活性的高低反映有機(jī)物降解過(guò)程中含氮物質(zhì)的礦化進(jìn)程，是表征堆肥腐殖化的重要指標(biāo)[25]。圖3a、3b、3c為不同沼渣堆肥過(guò)程中脲酶活性變化情況。在堆肥前期SLR和STR呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，其原因是開(kāi)始時(shí)易降解有機(jī)物質(zhì)充足，微生物分泌的脲酶將有機(jī)物中的脲素態(tài)氮水解為氨，隨著堆肥的進(jìn)行，脲素態(tài)氮含量減少和微生物活性減弱導(dǎo)致脲酶活性減弱；而VR則為先降低后增加，其中在第6天最低(0.39 mg/(g·d))，第18天達(dá)到最大值(270.47 mg/(g·d))，這可能由于在第6天時(shí)，pH值較低(4.44)，抑制了脲酶活性，隨后pH值增加，脲酶活性增加。在堆肥18 d后，脲酶活性降低，直至堆肥結(jié)束。在堆肥結(jié)束時(shí)，STR的脲酶活性最低，為1.93 mg/(g·d)，其次為VR(5.45 mg/(g·d))，SLR最高，為6.22 mg/(g·d)，說(shuō)明STR組有機(jī)物質(zhì)處于穩(wěn)定狀態(tài)且腐殖化程度較高。

多酚氧化酶可以將一些芳香族化合物氧化為醌，同時(shí)催化醌與堆肥體系中的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類(lèi)及礦物質(zhì)等反應(yīng)生成交聯(lián)狀的穩(wěn)定大分子物質(zhì)，利于堆肥的腐殖化[6]。由圖3d可以看出，SLR的多酚氧化酶活性在整個(gè)堆肥過(guò)程較低，這可能是因?yàn)槲勰嗾釉卸嗟鞍踪|(zhì)等易降解有機(jī)物，可刺激微生物分泌酶的底物含量較少，導(dǎo)致微生物分泌的多酚氧化酶較少；STR和VR在初始時(shí)多酚氧化酶活性較高，在第6天最低，隨后變化不大，但VR在24 d時(shí)增加隨后又降低，可能是由于微生物活性降低導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的累積；與SLR和VR相比，STR在整個(gè)堆肥過(guò)程中多酚氧化酶活性較高，在堆肥結(jié)束時(shí)，為2.04 mg/(g· h)，說(shuō)明秸稈沼渣堆肥在后期以蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的異養(yǎng)微生物代謝活性較低，促進(jìn)腐殖質(zhì)的形成，從而加速堆肥腐殖化進(jìn)程。

圖3 堆肥過(guò)程中脲酶和多酚氧化酶活性變化Fig.3 Changes of urease and polyphenol oxidase activities during composting

2.3 腐殖質(zhì)各組分含量及腐殖化程度的變化

堆肥過(guò)程中，纖維素被微生物降解后轉(zhuǎn)化為小分子化合物，如多糖等，此類(lèi)小分子物質(zhì)具有良好的生物降解性能并與氨基化合物聚合，可形成腐殖質(zhì)的前體物質(zhì)[7]。如表2所示，堆肥后，HS-C含量增加，且STR中HS-C含量最高，SLR、STR和VR分別增加了5.71%、10.56%、1.53%。腐殖質(zhì)主要是由胡敏酸和富里酸組成的一系列與微生物和酶有關(guān)的高分子有機(jī)聚合物。堆肥的腐殖化過(guò)程使HA-C含量增加，而FA-C含量降低，這與許多前人的研究結(jié)果一致[7,9,26]。SLR、STR和VR處理HA-C質(zhì)量比分別增加了17.55、17.30、3.07 g/kg，并且STR胡敏酸含量最高，這可能與原料中纖維素含量有關(guān)，同時(shí)影響微生物和酶的活性。堆肥后，SLR的FA-C含量變化最大，減少了31.33%，STR次之，VR變化最小。有研究表明富里酸減少主要是由于富里酸的分子較小，微生物可以利用轉(zhuǎn)化為分子大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜穩(wěn)定的胡敏酸[27]。

堆肥過(guò)程的腐殖化不僅要考慮腐殖質(zhì)、胡敏酸和富里酸含量的變化，更要認(rèn)清這些參數(shù)與TOC以及它們之間的相互關(guān)系。HR、HI、DP和PHA在堆肥前后變化如表2所示。在堆肥過(guò)程中有機(jī)碳逐漸腐殖化，最終使得堆肥系統(tǒng)穩(wěn)定。堆肥后HR增加，表明堿性條件下可溶性碳含量增加，而HI的增加則表明腐殖質(zhì)的結(jié)構(gòu)逐漸復(fù)雜，腐殖質(zhì)分子在逐漸增大。在堆肥過(guò)程中，前體物質(zhì)不僅參與了HS結(jié)構(gòu)的形成，還增加HS的芳香化程度。DP表示在HS中HA與FA的比例，堆肥后DP的增加表明堆肥過(guò)程中小分子FA轉(zhuǎn)化為大分子HA，增加了HS的復(fù)雜程度。PHA表示HA在HS中占有率，堆肥后PHA增加，表明HA在HS中的含量增加，由此表明HA是構(gòu)成HS的主要組分。堆肥后，相比SLR和VR，STR的HR、HI、DP和PHA最大，分別為28.89%、19.24%、1.99和66.60%，其次為SLR，VR最小，這可能原因是在STR中，纖維素的降解可提供更多的芳香化合物，使腐殖質(zhì)的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜和穩(wěn)定，加快堆肥腐熟。

表2 不同沼渣堆肥前后腐殖質(zhì)各組分及HR、HI、DP、PHA變化Tab.2 Changes of humus composition, HR, HI, DP and PHA before and after composting

注：HS-C表示腐殖質(zhì)碳，HA-C表示胡敏酸碳，F(xiàn)A-C表示富里酸碳。

2.4 堆肥前后腐殖酸分子量的變化

堆肥使有機(jī)物質(zhì)逐漸穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，即將小分子轉(zhuǎn)化為大分子。腐殖酸主要是由胡敏酸和富里酸組成，其中胡敏酸的分子量較大。如圖4所示，堆肥后腐殖酸的分子量增加，其中SLR在堆肥前后腐殖酸分子量的變化不明顯，胡敏酸和富里酸的分子量分別從堆肥前2 024 Da和585 Da變?yōu)槎逊屎? 061 Da和566 Da。對(duì)于STR和VR，腐殖酸的分子量分別從堆肥前3 284 Da和2 090 Da變?yōu)槎逊屎? 929 Da和3 990 Da，主要原因是堆肥后胡敏酸的分子量增加，使腐殖酸分子量增加。堆肥前后SLR中腐殖酸分子量沒(méi)有變，但其胡敏酸的含量增加(表2)，說(shuō)明在SLR中是小分子之間相互作用形成大分子胡敏酸，而大分子胡敏酸與小分子之間幾乎不發(fā)生相互作用。而對(duì)于STR和VR，不僅小分子之間發(fā)生相互作用，而且小分子與大分子胡敏酸之間也會(huì)發(fā)生相互作用，使胡敏酸的分子量增加，最終使腐殖質(zhì)的分子量增加。

2.5 溶解性有機(jī)物的三維熒光特性變化

腐殖質(zhì)一般是含有大量有機(jī)物、結(jié)構(gòu)復(fù)雜且不均勻的混合物，也包括不同基團(tuán)和分子量的多聚體以及各種熒光基團(tuán)[28]。圖5(圖中Ex、Em表示激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng))為不同沼渣堆肥前后DOM的三維熒光光譜變化。不同來(lái)源的DOM可能具有不同的熒光基團(tuán)，主要為類(lèi)蛋白熒光峰、簡(jiǎn)單芳香蛋白熒光峰、可見(jiàn)光區(qū)類(lèi)腐殖酸峰和紫外光區(qū)類(lèi)腐殖酸峰[29-31]。如圖5f所示，堆肥后出現(xiàn)了4個(gè)不同的熒光峰，在圖中標(biāo)記為A、B、C和D，其中A表示可見(jiàn)光區(qū)類(lèi)腐殖酸物質(zhì)，B表示紫外光區(qū)類(lèi)蛋白，C和D表示紫外光區(qū)類(lèi)腐殖酸和簡(jiǎn)單芳香蛋白。在堆肥前，SLR、STR和VR主要含B和D兩類(lèi)熒光物質(zhì)，且VR中含量更高。堆肥后，SLR處理出現(xiàn)了A類(lèi)物質(zhì)，B和D變化不明顯，但在STR和VR中出現(xiàn)了A和C兩類(lèi)物質(zhì)，并且B和D兩類(lèi)物質(zhì)含量減少，說(shuō)明A和C可能是由B、D類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化而成。與STR比，VR更明顯，可能是由于VR中B、D類(lèi)物質(zhì)含量多。由此可見(jiàn)，秸稈沼渣和醋糟的堆肥腐殖化效果較好。

3 結(jié)論

(1)分別以污泥沼渣、秸稈沼渣和醋糟為主要原料，與餐廚廢棄物和牛糞聯(lián)合進(jìn)行30 d堆肥實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，相比污泥沼渣，以秸稈沼渣和醋糟為主要原料可加快堆肥腐殖化進(jìn)程。

(2)秸稈沼渣堆肥過(guò)程中纖維素酶和多酚氧化酶具有較高的活性，脫氫酶和脲酶活性先增加后降低，加速了有機(jī)物的水解和腐殖化。

(3)相比秸稈沼渣和醋糟，污泥沼渣堆肥形成的腐殖酸分子較小，而且是小分子物質(zhì)之間相互聚合形成分子量較大的胡敏酸分子，為沼渣堆肥產(chǎn)品的應(yīng)用提供依據(jù)。