劉春菊，盛琰翔，王清華，遲田英，朱 琳，王英麗，馬洪超，王志亮，包靜月

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；

2. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江臨安 311300）

小 反 芻 獸 疫（peste des petits ruminants，PPR） 是 由 小反 芻 獸 疫 病 毒（ peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一種急性病毒性傳染病，主要感染山羊、綿羊以及野生小反芻獸，以發(fā)熱，眼、鼻分泌物增多以及胃炎、腹瀉和肺炎為特征。該病主要流行于亞洲和非洲。2007 年我國在西藏阿里地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)該病，2010 年8 月在阿里地區(qū)日土縣再次發(fā)現(xiàn)PPR 疫情[1]。2013 年末，該病傳入我國新疆地區(qū)，并迅速傳播至全國22 個省份，對我國養(yǎng)羊業(yè)造成嚴重危害[2-3]。通過疫苗免疫和移動控制等措施，該病目前在我國已得到有效控制。

PPRV 屬于副黏病毒科（Paramyxovirdae）麻疹病毒屬（Morbolivirus）；基因組為單股負鏈RNA，長度為15 948 nt 或者15 954 nt；基因組3'末端為前導(dǎo)序列（leader），5'末端為尾隨序列（trailer）；6 個基因排列順序為3'-N-P-M-FH-L-5'，依次編碼6 個結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝蛋白（H）和大蛋白（L），其中P 基因還編碼2 個非結(jié)構(gòu)蛋白C 和V。根據(jù)F 基因或N 基因部分核苷酸序列差異，將全球PPRV 毒株分為4個基因系[4-5]，其中在亞洲地區(qū)流行的毒株屬于基因4 系[1]。

PPRV H 基因核苷酸長度為1 830 nt，編碼609個氨基酸，編碼的H 蛋白分子質(zhì)量約為68.8 ku。H 蛋白和F 蛋白共同組成病毒囊膜糖蛋白。H 蛋白屬于II 型膜糖蛋白，以二硫鍵相連的二聚體或四聚體形式存在于病毒囊膜表面。H 蛋白負責(zé)與細胞表面受體結(jié)合，然后協(xié)助F 蛋白介導(dǎo)病毒和宿主細胞膜的融合[6]。成熟的H 蛋白由一個短的N 端胞質(zhì)側(cè)尾巴、一段疏水的跨膜區(qū)和一個大的C 端胞外結(jié)構(gòu)域組成。H 蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)象為一個柄和一個球狀頭部，球狀頭部含有抗原表位，能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體[7]。H 蛋白同時還具有神經(jīng)氨酸酶活性和血凝素活性。

本研究對2013—2017 年我國PPRV 流行毒株H 基因進行序列測定和分析，探討該病毒流行過程中的H 基因序列變異情況，掌握其分子演化特征，以期為該病控制和消滅策略的制定提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒來源

2014—2017 年 在9 個 省12 個 疫 點 采 集 的PPRV 陽性組織樣品，由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心保存并提供，具體樣品信息見表1。

表1 2014—2017 年我國12 株P(guān)PRV 毒株信息

1.2 病毒RNA 提取

取腸系淋巴結(jié)組織100 mg，用組織勻漿儀勻漿后，根據(jù)Roche 公司生產(chǎn)的High Pure Viral RNA Kit 的操作說明，提取病毒RNA，-80 ℃保存。

1.3 RT-PCR

采用TaKaRa 公司生產(chǎn)的Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit，對PPRV H 基因進行擴增：在50 μL 反應(yīng)體系中加入2×One Step Buffer 25 μL，Primerscript 1 step Enzyme Mix 2 μL，上、下游引物各2 μL，病毒RNA 5 μL。RT-PCR 反應(yīng)條件為：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃ 2 min，進行Taq 酶激活；40 個循環(huán)的PCR（94 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min）；72 ℃ 7 min 再延伸。對PCR 產(chǎn)物進行切膠回收。

1.4 序列測定和進化樹繪制

將純化后的PCR 產(chǎn)物送青島華大公司進行測序，獲得我國12 個毒株的H 基因序列。2013—2014 年我國25 個PPRV 流行毒株的基因組序列由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心測得并已提交GenBank，毒株相關(guān)信息見表2。從GenBank 下載我國西藏及其他國家的15 個PPRV 代表毒株基因組序列，毒株相關(guān)信息見表3。從上述病毒基因組序列中截取H 基因序列。

用MEGA 4.0 軟件進行序列比對，用最大似然法法構(gòu)建分子進化樹，bootstrap 測試1 000 次重復(fù)。用Simplot 軟件進行序列同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 H 基因核苷酸序列比較

2013—2017 年來自我國21 個省份37 個疫點的37 株P(guān)PRV 毒株H 基因核苷酸序列之間的遺傳距離為0～0.007 7。其中，2013 年12 月—2014 年6 月，15 個毒株的H 基因序列完全一致。這些毒株分別來自新疆（XJ22013、XJ32013、XJ42013）、重慶（CQ2014）、黑龍江（HLJ2014）、吉 林（JL2014）、 陜 西（SaX2014）、 云 南（YN2014）、江蘇（JS2014）、湖北（HB2014）、河 南（HNS2014）、 貴 州（GZ2014）、 湖 南（HN2014）、浙江（ZJ2014）、四川（SC2014）等13 個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）。2013 年12 月—2014 年4 月，來自新疆（XJ52013）、甘肅（GS2014）、遼寧（LN2014）、安徽（AH2014）、山西（SX2014）的5 個毒株H 基因序列完全一致。毒株XJ302017 與HN02017 之間的H 基因核苷酸序列差異最大，遺傳距離為0.007 7，共14 個位點存在序列差異。

表2 2013—2014 年我國PPRV 流行毒株信息

37 個毒株之間的核苷酸變異分布于H 基因的41 個位點。Simplot 分析結(jié)果（圖2）顯示，H 基因序列中，120～420 bp 間的序列同源性為100%，沒有突變發(fā)生。H 基因核苷酸序列在3 個區(qū)域變異較大，分別為680～820 bp、1 240～1 380 bp 和1 680～1 720 bp 區(qū)域。

H 基因41 個核苷酸變異位點中，24 個導(dǎo)致了氨基酸序列的改變（表4）：18 個變異發(fā)生于第1位密碼子，導(dǎo)致其中的15 個位點發(fā)生氨基酸改變；9 個變異位于第2 位密碼子，導(dǎo)致全部氨基酸發(fā)生改變；14 個變異發(fā)生于第3 位密碼子，未導(dǎo)致氨基酸改變。

表3 PPRV 參考毒株信息

圖1 2013—2017 年我國PPRV 毒株H 基因核苷酸序列同源性Simplot 分析結(jié)果

將XJYL2013 株與其余36 個毒株進行H 基因核苷酸序列比對，發(fā)現(xiàn)36 個毒株分別在1～9 個位點發(fā)生了突變。H 基因核苷酸序列突變位點數(shù)與毒株流行時間呈正相關(guān)，2016 年10 月以前的32 個毒株，突變位點為1～6 個，2016 年10 月以后的4個毒株，突變位點為8～9 個。

2.2 H 基因編碼氨基酸序列比較

2013—2017 年我國37 株P(guān)PRV 毒株H 基因編碼氨基酸序列之間的遺傳距離為0～0.013 2。H基因編碼的609 個氨基酸位點中，24 個位點發(fā)生了突變：胞內(nèi)區(qū)（1～34 位aa）有3 個位點發(fā)生了突變，跨膜區(qū)（35～58 位aa）有1 個位點發(fā)生突變，胞外長柄區(qū)（59～181 位aa）有3 個位點發(fā)生突變，胞外球狀頭部區(qū)（182～609 位aa）有17 個位點發(fā)生突變。

表4 2013—2017 年我國PPRV 毒株H 基因核苷酸和編碼氨基酸序列變異情況

2.3 H 基因序列差異分析

2013—2017 年我國37 株P(guān)PRV 流行毒株與15 株P(guān)PRV 代表毒株的H 基因核苷酸序列遺傳距離為0.019 5～0.146 9，其中與2007—2008 年我國西藏地區(qū)流行毒株H 基因核苷酸序列遺傳距離為0.019 5～0.025 7，而西藏地區(qū)流行毒株之間的H基因核苷酸序列遺傳距離為0.000 5～0.002 7。與15 株P(guān)PRV 代表毒株進行序列比對，發(fā)現(xiàn)2013—2017 年我國37 株P(guān)PRV 流行毒株H 基因的13 個位點發(fā)生了核苷酸序列突變，其中9 個導(dǎo)致了氨基酸序列的改變（表4）：3 個變異位于第1 位密碼子，3 個變異位于第2 位密碼子，全部導(dǎo)致氨基酸改變；6 個變異位于第3 位密碼子，3 個導(dǎo)致氨基酸改變。

2013—2017 年我國37 株P(guān)PRV 流行毒株與15 株代表毒株H 基因編碼氨基酸序列的9 個變異位點位于179～591 aa 之間，全部位于H 蛋白的胞外區(qū)，其中8 個變異位點位于胞外球狀頭部區(qū)。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

基于H 基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)2013—2017 年我國37 株P(guān)PRV 流行毒株構(gòu)成基因4 系中一個獨立的進化小分支，而我國西藏地區(qū)流行毒株與印度2014 年毒株形成一個小分支（圖2）。

圖2 PPRV 毒株H 基因分子進化樹

3 討論

本研究對2013—2017 年我國21 個省份37 個疫點的PPRV 流行毒株H 基因進行序列分析，探明了PPRV 流行過程中H 基因序列變異情況，為PPR 控制和消滅策略的制定提供了數(shù)據(jù)支持。

2013—2017 年我國37 個PPRV 流行毒株的H 基因變異較大。PPRV 在我國流行的4 年間，H基因的41 個核苷酸位點發(fā)生了突變，其中24 個位點導(dǎo)致了氨基酸序列的改變，非同義突變率為58.5%。之前的研究[8]發(fā)現(xiàn)，2013 年11 月—2014年6 月，25 個毒株H 基因的7 個位點發(fā)生突變，其中4 個位點導(dǎo)致氨基酸序列的改變，非同義突變率為57.1%。本研究和之前的研究都發(fā)現(xiàn)，H 基因的非同義突變主要由第1 位和第2 位密碼子的突變引起。PPRV 在我國流行過程中，其突變在H 基因中隨機分布，突變位點數(shù)量與流行時間呈正相關(guān)。因此，持續(xù)實時監(jiān)測PPRV H 基因分子變異，對于該病的防控具有重要意義。

2013—2017 年我國流行的PPRV 毒株在分子進化樹中聚類為一個獨立小分支，相比于其他PPRV 代表毒株，這些毒株的H 基因在13 個位點發(fā)生了特征性的核苷酸突變，其中9 個位點導(dǎo)致了氨基酸序列的改變，而且這些突變的氨基酸位點主要位于胞外區(qū)。作為重要的抗原蛋白，H 蛋白的胞外球狀頭部含有抗原表位，能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體。對于我國PPRV 流行毒株H 蛋白氨基酸改變能否導(dǎo)致其抗原性改變，還需進一步研究。