呂 旭，蘇 倩，劉曉磊，陸 靜，方 偉，王文龍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，

內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

家畜養(yǎng)殖過程中長期不科學(xué)地濫用抗寄生蟲藥，使得全世界范圍的寄生蟲相繼出現(xiàn)抗藥性[1-2]，部分地區(qū)已經(jīng)嚴重到了無藥可用的地步，這些問題給畜牧業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失，已成為世界性問題。對寄生蟲進行耐藥性體外檢測是控制寄生蟲耐藥性產(chǎn)生的重要手段之一。而蟲卵孵化試驗[3]（egg hatch assays，EHAs）、幼蟲麻痹移行活力測試[4]、幼蟲發(fā)育試驗[5]、靜止期幼蟲形態(tài)分析[6]、幼蟲采食抑制試驗[7]、寄生蟲基因組學(xué)研究[8]和分子生物學(xué)研究[9]等都需要孵化幼蟲，因此糞便中的蟲卵孵化率是決定這些試驗或研究成敗的重要因素。這些體外試驗或研究大都需要新鮮糞便樣品，這給樣品采集帶來不便，因而新鮮糞便樣品的保存、留樣顯得尤為重要。目前，糞便樣品的長時間保存是否會影響到后續(xù)的試驗或研究進程鮮有報道?；谶@個因素，現(xiàn)將4 ℃無氧環(huán)境下，糞便保存時間對蟲卵孵化率的影響作一系統(tǒng)分析，旨在選擇一個較為理想的糞便保存時間，為綿羊消化道線蟲的耐藥性試驗或研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

內(nèi)蒙古烏蘭察布市察哈爾右翼后旗某羊舍蟲卵數(shù)（EPG）≥10 000 的綿羊新鮮糞便，以及飽和食鹽水、生理鹽水、1640 培養(yǎng)液、PBS 緩沖液（含有250 mg/L的兩性霉素B和10 mL/L的青鏈霉素）、24 孔培養(yǎng)板、倒置顯微鏡、溫箱、離心機、真空封口機等。

1.2 糞便保存

將采集的新鮮綿羊顆粒狀糞便裝入真空袋（70 mm×100 mm），10 g/組，用真空封口機將真空袋密封，放入4 ℃冰箱。野外環(huán)境下，及時將采集的新鮮糞便放入含有冰袋的保溫箱中，并盡快放入4 ℃冰箱。

1.3 蟲卵收集

參考世界獸醫(yī)寄生蟲學(xué)促進協(xié)會（WAAVP）推薦的蟲卵孵化試驗EHAs 方法[10-11]，并對蟲卵提取系統(tǒng)進行調(diào)整，收集線蟲卵，制備蟲卵混懸液。取10 g 4 ℃無氧環(huán)境保存的綿羊糞便，加入50 mL 自來水充分攪拌備用；將500、145、20 μm 3 種銅篩，從上至下依次疊放，把攪拌好的糞汁倒入500 μm 銅篩并平鋪開，等待5 min；用生理鹽水沖洗20 μm 銅篩中的沉積物，將沉積物用吸管吸入50 mL 離心管，3 000 r/min 離心5 min，棄掉上清液；加入飽和食鹽水混合均勻，3 000 r/min 離心3 min，收集上清液；將上清液傾入20 μm 銅篩中，用生理鹽水沖洗10～20 s，然后再次用吸管吸入50 mL 于離心管中，3 000 r/min 離心5 min；棄掉上清液，加入PBS 緩沖液稀釋，得到每1 mL 含有（170±20）個蟲卵的混懸液，備用。蟲卵混懸液在每次蟲卵孵化前現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 蟲卵孵化

采用24 孔培養(yǎng)板，孔內(nèi)加入1 mL 含有（170±20）個蟲卵的混懸液和1 mL 1640 培養(yǎng)液，每次試驗設(shè)6 個重復(fù)，用封口膜密封，27 ℃孵育48 h；取出24 孔培養(yǎng)板，加入2 滴Lugol's 液終止孵化，在顯微鏡下計數(shù)每個孔中幼蟲和蟲卵的具體數(shù)量；取6 孔數(shù)據(jù)平均值，并計算蟲卵孵化率。自糞便采集日起，分別在采集后0、3、6、9、12、15、18 和21 d 重復(fù)進行蟲卵孵化試驗，共進行8 次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用Microsoft Excel 2010 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，并取每次試驗的平均值繪制折線統(tǒng)計圖。蟲卵孵化率=[平均幼蟲數(shù)/（平均幼蟲數(shù)+平均蟲卵數(shù)）]×100%

2 結(jié)果與分析

結(jié)果顯示，4 ℃無氧環(huán)境下，綿羊糞便在保存0、3、6、9、12、15、18 和21 d 的蟲卵孵化率 分 別 為90.07%、78.85%、67.02%、50.51%、22.18%、9.21%、9.94%和9.68%（表1）。

表1 4 ℃無氧環(huán)境保存不同時間的蟲卵孵化情況統(tǒng)計

數(shù)據(jù)分析顯示，糞便中的線蟲卵在采集當(dāng)天孵化率達到90%以上，但隨著保存時間的延長，蟲卵孵化率逐漸降低，其中保存9 d 內(nèi)的蟲卵孵化率下降較平緩，9 d 時仍有50.51%的蟲卵能夠得到良好的孵化，但9 d 后的蟲卵孵化率急劇下降至22.18%，15 d 后孵化的幼蟲數(shù)極少，孵化率無明顯變化。

3 討論

新鮮綿羊糞便的低溫?zé)o氧保存限制了糞便中線蟲卵發(fā)育所需的適宜條件，使蟲卵啟動自身保護機制而停止發(fā)育，從而有效抑制了糞便保存過程中蟲卵發(fā)育成幼蟲。由于EHAs 等寄生蟲耐藥性體外檢測方法均需要未發(fā)育的蟲卵[10]，只能使用新鮮糞便或一定時限的低溫?zé)o氧保存糞便。但低溫?zé)o氧保存時限過長，也會影響這些方法的準確性和適用范圍，若時限過長，糞便中的蟲卵會發(fā)育，就可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。之前有研究人員報道，新鮮糞便放入4 ℃無氧環(huán)境中可保存3 d。本研究發(fā)現(xiàn)，4 ℃無氧保存線蟲卵9 d 后，仍有50%以上的蟲卵可用于試驗，這極大擴展了EHAs 等試驗的適用范圍，尤其是對需要在農(nóng)區(qū)、牧區(qū)、野外等環(huán)境下采集糞便的試驗，以及采集成本高、過程困難的試驗具有極大幫助。

目前國內(nèi)外針對氧含量是否對糞便中線蟲卵發(fā)育有影響的研究較少，對低溫條件是否會抑制蟲卵發(fā)育的研究較多。WAAVP 報道，有研究人員將蟲卵厭氧保存方法成功應(yīng)用于捻轉(zhuǎn)血矛線線蟲、蛇形毛圓線蟲、奧氏奧斯特線蟲等[11]。Bevevridge等[12]在4～10 ℃條件下研究了澳大利亞東部的糞便毛圓線蟲卵孵化率是否會受低溫影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫降低了蛇形毛圓線蟲等蟲卵的孵化率，但對透明毛圓線蟲卵的孵化率幾乎沒有影響。陳能橋等[13]在貴州遵義市研究了牛羊消化道線蟲卵在-3～3 ℃環(huán)境下是否會影響發(fā)育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫對毛圓線蟲、捻轉(zhuǎn)血毛線蟲、古柏線蟲、食道口線蟲的蟲卵影響較大，在-3～3 ℃環(huán)境保存72 h后，有94%的蟲卵變性死亡。

不同的溫度和保存時限影響消化道線蟲卵的孵化率，這與蟲卵地理分布、種屬差異等有一定的關(guān)系[12，14-15]。如貴州遵義市冬季平均氣溫3 ℃，內(nèi)蒙古烏蘭察布察哈爾右翼后旗冬季平均氣溫-15.7 ℃，兩地線蟲卵由于地理分布不同，通過長期的蟲卵或幼蟲越冬淘汰，后者在4 ℃環(huán)境下的生存能力強于前者，因而保存時限也會所不同。低溫環(huán)境會對線蟲卵孵化形成一定的影響，因此低溫?zé)o氧保存的糞便樣品一般不適用于蟲種鑒定，如4 ℃保存可能影響捻轉(zhuǎn)血毛線蟲的孵化[16]。

本試驗結(jié)果表明，4 ℃無氧保存新鮮綿羊糞便最長時限為9 d，之后蟲卵大量死亡，無法達到長期保存、留樣的目的。這可能是因為蟲卵長時間處于低溫、無氧環(huán)境中，蟲卵自身營養(yǎng)逐漸消耗，保存糞便用的真空袋殘留的微量氧氣也消耗殆盡，致使大部分蟲卵死亡。但9 d 后導(dǎo)致蟲卵孵化率迅速降低的具體因素，是蟲卵本身的原因，還是保存條件對其產(chǎn)生了不利影響，有待今后進一步研究。