郭恒科，譚 鑫，庫(kù)旭鋼，范盛先，何啟蓋，孟憲榮

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070）

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是冠狀病毒科成員，由其引起的豬流行性腹瀉（PED）是一種以急性水樣腹瀉和脫水為特征的腸道疾病[1]。PED在多個(gè)國(guó)家呈地方性和季節(jié)性暴發(fā)，導(dǎo)致新生仔豬死亡以及育肥豬體重減輕，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2]。使用疫苗免疫是預(yù)防本病的最主要措施，但目前尚缺乏有效的免疫效果評(píng)估方法?，F(xiàn)行的PEDV 抗體檢測(cè)方法，如間接免疫熒光和中和試驗(yàn)等大都過(guò)程復(fù)雜，不適合臨床使用。傳統(tǒng)的間接血凝試驗(yàn)（HA）操作簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)實(shí)用，是疾病診斷的經(jīng)典方法之一，已被廣泛用于具有這種特性病毒的定性和定量分析，包括正黏病毒、副黏病毒和腦心肌炎病毒等[3-4]。另外，如果存在抗病毒抗體時(shí)，由病毒引起的凝集作用將被抑制，所以間接血凝抑制試驗(yàn)（HI）可用于抗病毒抗體的檢測(cè)。

同屬冠狀病毒，如豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV），可凝集牛紅細(xì)胞，而PEDV 在自然狀態(tài)下不具有血凝活性[2]。2010 年，韓國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，將PEDV 細(xì)胞適應(yīng)株（KPEDV-9 和SM98LVec）經(jīng)胰蛋白酶或神經(jīng)氨酸酶處理之后，可以凝集兔的紅細(xì)胞而表現(xiàn)出血凝特性[3]。

本試驗(yàn)通過(guò)確定PEDV 的HA 活性特點(diǎn)，為建立HA 和HI 試驗(yàn)方法，評(píng)估疫苗免疫豬的抗體水平奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1 .1 材料

1.1.1 病毒株 YN13 株（GenBank accession No.KF761675）及傳代致弱的YN144 株：由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；CV777 株（GenBank accession No.AF353511）：由天邦生物制品有限公司（ 成 都） 惠 贈(zèng)；DR13 株（Genbank accession No.JQ023162.1）：由本實(shí)驗(yàn)室從弱毒疫苗中分離得到。所有病毒株均經(jīng)VERO 細(xì)胞培養(yǎng)，測(cè)定TCID50后，-80 ℃保存。

1.1.2 紅細(xì)胞 雞、兔和豬紅細(xì)胞：來(lái)自于健康動(dòng)物。

1.1.3 血清和乳清 PEDV 抗體陰、陽(yáng)性血清和乳清：來(lái)自疫苗免疫后豬，并經(jīng)IFA 和ELISA 試驗(yàn)檢測(cè)鑒定；豬乙型腦炎病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬口蹄疫病毒、豬傳染性胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌、豬圓環(huán)病毒抗體陽(yáng)性參考血清：由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。

1.1.4 耗材和試劑 96 孔V 型板、抗凝管：山東奧賽特醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；胰蛋白酶：Sigma公司產(chǎn)品；25%戊二醛：國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品；配制0.01 mol/L PBS 的化學(xué)試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 紅細(xì)胞制備和醛化

參考《獸醫(yī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[5]中的方法，制備4%的動(dòng)物紅細(xì)胞。將4%的紅細(xì)胞用PBS配制成1%的細(xì)胞懸液，再在4 體積的懸液中加入1 體積的2.5% 戊二醛溶液（即40 mL 1% 的紅細(xì)胞懸液加上10 mL 的戊二醛溶液，需邊攪拌邊緩慢加入），放在磁力攪拌器上攪拌45 min。攪拌完成后，用PBS 洗滌醛化后的紅細(xì)胞，然后3 000 r/min 離心5 min，共4 次。最后再用PBS（pH7.1）將其配成1%的醛化紅細(xì)胞懸液[6-7]。將醛化紅細(xì)胞放在4 ℃冰箱中備用。

2.2 HA 和HI 試驗(yàn)

先將CV777、DR13、YN14 和YN144 等PEDV 毒株在37 ℃下，用5 μg/mL 的胰蛋白酶作用30 min。再參考《獸醫(yī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[5]中的HA 試驗(yàn)步驟進(jìn)行操作和結(jié)果判定。將病毒用含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS 連續(xù)2 倍稀釋?zhuān)瑢?duì)病毒和紅細(xì)胞37 ℃作用15 min，每個(gè)病毒設(shè)置4 個(gè)重復(fù)。

根據(jù)HA 試驗(yàn)得到的病毒血凝價(jià)，將其配制成4 單位（4 U）抗原。參考《獸醫(yī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》中HI 試驗(yàn)步驟進(jìn)行操作和結(jié)果判定，其中病毒和血清（乳清）的作用時(shí)間為室溫1 h，紅細(xì)胞震蕩混勻后37 ℃作用15 min，設(shè)置4 個(gè)重復(fù)。

2.3 紅細(xì)胞種類(lèi)和胰蛋白酶對(duì)HA 試驗(yàn)的影響

分別用制備好的醛化兔、雞和豬紅細(xì)胞與經(jīng)過(guò)胰蛋白酶處理的PEDV 病毒液做HA 試驗(yàn)。確定紅細(xì)胞種類(lèi)后，再分析胰蛋白酶濃度對(duì)PEDV HA試 驗(yàn) 的 影 響。 先 將CV777、DR13、YN13和YN144，37 ℃下分別用0、5、10、50、100 μg/ mL 胰蛋白酶（Sigma）處理30 min，然后用含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS 連續(xù)2倍稀釋?zhuān)瑓⒖?.2 完成HA 試驗(yàn)。每個(gè)胰蛋白酶濃度處理的病毒做4 個(gè)重復(fù)。

2.4 HI 試驗(yàn)的特異性檢驗(yàn)

分別用豬乙型腦炎病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬口蹄疫病毒、豬傳染性胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌、豬圓環(huán)病毒和PEDV 陽(yáng)性參考血清，做PEDV HI 試驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 紅細(xì)胞種類(lèi)和胰蛋白酶對(duì)HA 試驗(yàn)的影響

用胰蛋白酶處理4 株P(guān)EDV 毒株后發(fā)現(xiàn)，PEDV 對(duì)兔源紅細(xì)胞表現(xiàn)出HA 活性，對(duì)豬源和雞源紅細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出HA 活性（表1）。不同濃度的胰蛋白酶處理病毒結(jié)果顯示，用5 μg/ mL或以上濃度的胰蛋白酶處理，CV777 和DR13 毒株在37 ℃下，對(duì)兔紅細(xì)胞表現(xiàn)出HA 活性，并且胰酶濃度越高，表現(xiàn)越明顯，YN13 和YN144 株不需要經(jīng)過(guò)胰酶處理，就可以使1%兔紅細(xì)胞發(fā)生凝集（圖1）。

表1 紅細(xì)胞種類(lèi)對(duì)PEDV HA 試驗(yàn)的影響

3.2 HI 試驗(yàn)及其特異性

將YN13 株配制成4 單位（4 U）抗原，用PEDV 抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行HI 試驗(yàn)（2 個(gè)重復(fù)），結(jié)果如圖2，表明PEDV 的HA 活性能夠被特異性抗體所抑制。PEDV 抗體陽(yáng)性乳清HI 特異性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，樣品的HI 效價(jià)見(jiàn)表2；HI 特異性試驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，只有PEDV 抗體陽(yáng)性組出現(xiàn)血凝抑制，其他常見(jiàn)豬病病原的抗體陽(yáng)性血清組都出現(xiàn)了血凝現(xiàn)象，證明其特異性較高。

A. DR13；B. YN13；C. CV777；D. YN144；E. 空白對(duì)照。圖1 不同濃度胰蛋白酶處理的PEDV HA 試驗(yàn)結(jié)果

圖2 血清樣品的HI 試驗(yàn)結(jié)果

圖3 乳清樣品的HI 試驗(yàn)結(jié)果

圖4 PEDV HI 特異性試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

HA 是許多病毒共有的可廣泛用于臨床診斷的血清學(xué)特性。冠狀病毒科成員在凝集紅細(xì)胞能力方面存在較大差異，一些冠狀病毒僅在特殊條件下才會(huì)與相應(yīng)的靶紅細(xì)胞發(fā)生凝集。部分冠狀病毒表面有HE 蛋白，其與C 型流感病毒的血凝素蛋白有結(jié)構(gòu)和功能上的關(guān)系，并且可能是通過(guò)C 型流感病毒的HE mRNA 與冠狀病毒的基因組RNA 重組衍生而來(lái)的[8-9]。戊型肝炎病毒（HEV）在室溫下容易凝集雞紅細(xì)胞。對(duì)于鼠肝炎病毒（MHV）來(lái)說(shuō)，雖然有幾種毒株含有HE 糖蛋白，但是僅有MHV—幼鼠腹瀉病毒（DVIM）可引起血凝[12]。而傳染性支氣管炎病毒（IBV）需經(jīng)胰蛋白酶、磷脂酶C和神經(jīng)氨酸酶等處理后才表現(xiàn)HA 活性[13]。TGEV可以凝集雞源、豚鼠源和牛源紅細(xì)胞，在4 ℃時(shí)不凝集小鼠和鵝的紅細(xì)胞[3，10]。PEDV 的HA 活性需要胰蛋白酶處理后誘導(dǎo)[3，10-11]，這可能與其可促進(jìn)細(xì)胞與病毒之間膜融合的S2 蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)[14-16]。此外，具有重要生物學(xué)功能的S 蛋白，在宿主體內(nèi)主要介導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生[17]。

表2 陽(yáng)性樣品的HI 效價(jià)

本試驗(yàn)探索了4 種PEDV 株HA 活性特征，發(fā)現(xiàn)4 種毒株都能夠凝集兔紅細(xì)胞，但不能凝集雞源和豬源紅細(xì)胞。此外，CV777 和DR13 毒株的HA 活性與TGEV 和IBV 的HA 活性相類(lèi)似，都是由胰蛋白酶的蛋白水解而引發(fā)的，這與韓國(guó)學(xué)者的研究結(jié)果一致[3]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，YN 株及其弱毒YN144 株不需要經(jīng)過(guò)胰蛋白酶處理就具有HA 活性，說(shuō)明PEDV 的HA 活性具有毒株特異性。

HI 試驗(yàn)結(jié)果表明，PEDV 的血凝抑制試驗(yàn)特異性較高。PEDV 在經(jīng)過(guò)胰蛋白酶處理后與兔紅細(xì)胞有血凝現(xiàn)象，并且能被血清或者乳汁中的特異性抗體所抑制，據(jù)此可以建立PEDV 的HA/HI 診斷方法。研究發(fā)現(xiàn)，PEDV YN13 株和其致弱毒株YN144 的血凝想現(xiàn)象不受胰蛋白酶影響，說(shuō)明HA能力與PEDV 毒力無(wú)關(guān)。另外，用YN144 株作為弱毒疫苗使用時(shí)，可以用HA 試驗(yàn)做鑒別診斷。