王 巍，烏云塔娜，格根塔娜，劉連發(fā)，田宗民，邱 凱，蘇日古格，賈長生，王冠玉，趙忠武

（1. 內(nèi)蒙古呼倫貝爾市獸醫(yī)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古海拉爾 021000；

2. 新巴爾虎右旗動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古新巴爾虎右旗 021300；

3. 海拉爾區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古海拉爾 021000）

巴氏桿菌屬（Pasteurellaceae）是發(fā)現(xiàn)較早的一類細菌，已報道有多種。根據(jù)《伯杰氏鑒定細菌手冊》，本屬細菌主要有多殺性巴氏桿菌、溶血性巴氏桿菌、侵肺巴氏桿菌、產(chǎn)氣巴氏桿菌、雞巴氏桿菌等。它們在形態(tài)上頗為相似，但在致病性、生化特性和抗原性上不盡相同。多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）是本屬中最重要的致病菌，巴氏桿菌病主要由其引起。該菌具有異質(zhì)性特征，可導(dǎo)致豬肺疫、禽霍亂以及牛、羊、兔出血性敗血癥等危害嚴(yán)重的畜禽傳染病。巴氏桿菌病潛伏期短，傳播速度快，死亡率高，可呈暴發(fā)性流行，常對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，屬我國規(guī)定的二類動物疫病[1-2]。

因多殺性巴氏桿菌的莢膜抗原具有不相同的性質(zhì)，按照Carter 等[3]提出的血清學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分型方法以及間接血凝試驗數(shù)據(jù)，將其分為 A、B、D、E、F 5 個莢膜血清群，其中A 群菌株的莢膜主要為透明質(zhì)酸，B 群和E 群的是酸性多糖[4]。據(jù)報道，在我國畜禽中流行的多殺性巴氏桿菌莢膜血清群主要是A、B、D 3 個群。莢膜血清群雖然決定了巴氏桿菌的免疫原性，但各血清群之間多數(shù)無交叉免疫原性，比如免疫了B 群多殺性巴氏桿菌，卻無法保護畜禽抵御A 群的攻擊，因此利用分子生物學(xué)手段鑒定多殺性巴氏桿菌以及對該菌進行莢膜分型就顯得尤為重要[5]。

呼倫貝爾市近年來牛、羊多殺性巴氏桿菌病時有發(fā)生。目前對牛使用的疫苗株為B 型，而對羊尚無疫苗可用，且全市羊源巴氏桿菌莢膜血清群的流行狀況呈空白狀態(tài)。本研究通過建立多殺性巴氏桿菌分子生物學(xué)診斷方法，利用多重PCR 技術(shù)，對呼倫貝爾市羊源多殺性巴氏桿菌進行檢測，以掌握該市羊源多殺性巴氏桿菌莢膜血清群流行情況，同時進行藥物敏感性試驗，找到針對本地區(qū)流行株的敏感藥物，為多殺性巴氏桿菌病的流行病學(xué)監(jiān)測、防控和診斷治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2017 年1 月至2018 年10 月，本實驗室共收集呼倫貝爾市35 份疑似巴氏桿菌感染病羊肺組織病料。大部分病羊主要表現(xiàn)為，體溫升高、精神沉郁、食欲廢絕、咳嗽、腹瀉、眼結(jié)膜潮紅，有的頸部發(fā)生水腫，病程為2～5 d；個別羊突然發(fā)病，全身寒戰(zhàn)、虛弱、呼吸困難并伴有抽搐等癥狀，數(shù)小時內(nèi)死亡。大部分病死羊剖檢可見，胸腔內(nèi)有黃色積液，肺淤血、充血、水腫，有小出血點和肝變，脾臟腫大且邊緣不齊，胃腸道有出血性炎癥，心臟蒼白、質(zhì)地柔軟。少數(shù)病死羊組織器官病變不明顯，僅肺部有病變。

1.2 試驗材料

酵母提取粉、胰蛋白胨：均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；革蘭氏染色液、瑞士染色液：購自南京建成科技有限公司；DL 2 000 bp DNA Marker、Hot Master Tag DNA Polymerase 聚合酶、細菌基因組 DNA 提取試劑盒：均購自天根生化科技（北京）有限公司；抗菌藥敏紙片：購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 實驗室鏡檢

將35 份肺組織取新鮮部位進行涂片、干燥、固定，用革蘭氏染色法和瑞士染色法染色鏡檢，觀察形態(tài)特征。

1.4 細菌培養(yǎng)

將35 份肺組織分別取新鮮部位劃線接種于LB 血瓊脂平板固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況，并將疑似菌落進行染色鏡檢。同時取新鮮無菌病料，劃線接種于普通LB 瓊脂培養(yǎng)基及麥康凱培養(yǎng)基。

1.5 細菌DNA 提取

挑取不同肺組織LB 血瓊脂平板上單個菌落，接種于含5% 胎牛血清的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃200 r/min，震蕩孵育18～24 h；分別取2 mL 培養(yǎng)菌液 2 500 g 離心10 min，棄上清；采用天根生化科技（北京）有限公司細菌DNA 提取試劑盒進行DNA 提取。

1.6 雙重PCR 鑒定

參考Townsend 等[6]研究合成的多殺性巴氏桿菌特異性KMT1 基因引物以及A、B、D、E、F 群的莢膜血清群特異性基因引物（表1），引物由北京華大基因生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將上述1.5 步驟提取的基因組DNA 作為PCR 擴增模板，先用鑒定巴氏桿菌KMT1 基因的引物擴增待檢樣品，然后利用鑒定莢膜血清群capA、capB、capD、capE、capF 基因的引物進行雙重PCR 擴增目標(biāo)序列。兩輪PCR 反應(yīng)體系及條件一樣，采用50 μL 反應(yīng)體系：上下游引物各2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μL，ddH2O 34.5 μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL，含MgCl2）0.5 μL，DNA 模板2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min 預(yù)變性；94 ℃ 30 s 變性，55 ℃ 30 s 退火，72 ℃ 45 s 延伸，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min 后延伸。

1.7 序列測定和進化樹分析

將擴增出的陽性樣品送吉林庫美生物技術(shù)有限公司測序鑒定，將結(jié)果與Genbank 發(fā)表的多殺性巴氏桿菌序列進行比對分析。搜索Genbank 中已提交的多殺性巴氏桿菌序列，應(yīng)用BioEdit 軟件，與測序陽性樣品進行序列比對，用MEGA 7.0 軟件，繪制進化樹進行同源性分析。

表1 多殺性巴氏桿菌特異引物序列

1.8 藥敏試驗

藥敏試驗參照國家檢驗操作規(guī)程，采用K-B紙片瓊脂擴散法[7]，對分離鑒定株進行9 種抗菌藥的耐藥性檢測，包括青霉素、鏈霉素、克林霉素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素。具體步驟：將待檢菌落劃線接種至含5% 胎牛血清的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃200 r/min，震蕩孵育18～24 h；次日，用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至108CFU/mL，取100 μL 菌液至LB 鮮血固體瓊脂平板上，并涂抹均勻。在保持紙片間適當(dāng)距離的基礎(chǔ)上，用無菌鑷子把各藥敏片按順序平鋪于培養(yǎng)基表面，室溫放置吸收5 min 后，倒置于37 ℃溫箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)24 h。藥物選擇參照呼倫貝爾市羊病常用藥物及相關(guān)文獻[2，8-11]，判定方法參照杭州微生物試劑有限公司藥敏紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑≥15 mm 判定為敏感，10～15 mm判定為中度敏感（中介），＜10 mm 判定為耐藥。

2 結(jié)果

2.1 菌株形態(tài)特征和生長特性

35 份病料中，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，有21 份可見兩端鈍圓、兩極著色的陰性短桿菌；瑞士染色發(fā)現(xiàn)無鞭毛及芽孢，莢膜顯著。將35 份病料接種于LB 血瓊脂固體培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)上述21 份鏡檢陽性病料的分離菌株在血平板上生長良好，呈清亮、淡灰白色露珠狀，且濕潤黏稠，菌落周圍不溶血，而在普通LB 瓊脂培養(yǎng)基上生長貧瘠，幾乎不生長，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長。上述鏡檢陰性的14份病料在3 種培養(yǎng)基上均無菌落生長（圖1）。

2.2 雙重PCR 鑒定

21 份培養(yǎng)的陽性菌株用多殺線巴氏桿菌特異性KMT1 基因引物均擴增出460 bp 的片段，用特異性 KMT1 基因引物，分別與A、B、D、E、F 群的莢膜血清群特異性引物進行雙重PCR 擴增，發(fā)現(xiàn)其中12 份樣品KMT1 和B 群引物擴增出近460 bp和760 bp 兩條特異性條帶，9 份樣品KMT1 和D群引物擴增出近460 bp和648 bp兩條特異性條帶，21 份樣品中KMT1 和A 群、KMT1 和E 群、KMT1和F群都只擴增出一條460 bp的特異性條帶（圖2）。

A. 血平板；B. 革蘭氏染色（1 000×）；C. 瑞氏染色（1 000×）。圖1 分離菌株血平板培養(yǎng)生長情況及革蘭氏、瑞氏染色鏡檢結(jié)果

A. KMT1 引物鑒定；B. D 群莢膜血清群鑒定；C. B 群莢膜血清群鑒定；M. DL 2 000 bp DNA Maker；1～5.樣品。圖2 部分樣品多殺性巴氏桿菌PCR 以及莢膜血清群鑒定結(jié)果

2.3 測序結(jié)果比對和遺傳進化分析

試驗分離到12 株B 群多殺性巴氏桿菌，序列一致（命名HLBEB）；9 株D 群多殺性巴氏桿菌，序列一致（命名HLBED）。應(yīng)用生物軟件MEGA 7.0，對獲得的B 群、D 群巴氏桿菌進行序列分析，繪制了遺傳進化樹（圖3）。將獲得的兩種莢膜血清群基因序列與國內(nèi)外已發(fā)表的參考菌株基因序列進行同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B 群與CP023305 同源性最高，D 群與KY825087 同源性最高，均為100%，二者與其他地區(qū)提交序列也有較高同源性，在97%～100%之間。

圖3 分離菌株KMT1 基因遺傳進化分析

2.4 各地區(qū)菌株分離鑒定

35 份病料采自呼倫貝爾市5 個旗市區(qū)，共分離出21 株多殺性巴氏桿菌，包括B 群12 株、D群9 株。其中：鄂溫克族自治旗采集13 份病料，鑒定出8 份陽性，以D 群為主；新巴爾虎左旗采集7 份病料，鑒定出4 份陽性，以B 群為主；新巴爾虎右旗采集6 份病料，鑒定出5 份陽性，以B群為主；海拉爾區(qū)采集4 份病料，鑒定出4 份陽性，B 群、D 群均存在；阿榮旗采集5 份病料，未分離出多殺性巴氏桿菌（表2）。

表2 各地區(qū)羊源多殺性巴氏桿菌分離與鑒定結(jié)果單位：份

2.5 藥敏試驗

不同地區(qū)分離出的菌株對9 種抗生素的耐藥結(jié)果略有差異：鄂溫克族自治旗、新巴爾虎右旗、海拉爾區(qū)分離菌株，均對青霉素、鏈霉素產(chǎn)生了耐藥性，而新巴爾虎左旗的分離菌株這兩種藥中度敏感；新巴爾虎左旗、海拉爾區(qū)分離菌株都對卡那霉素產(chǎn)生了耐藥，而鄂溫克族自治旗、新巴爾虎右旗分離菌株對其中度敏感。不同地區(qū)分離菌株對9 種抗菌藥的耐藥情況見表3。

表3 不同地區(qū)分離菌株B 群、D 群的藥敏試驗結(jié)果

總體來看，呼倫貝爾市流行的B 群多殺性巴氏桿菌，對青霉素、鏈霉素、卡那霉素耐藥率較高，分別為66.7%、66.7%、50.0%，對克林霉素、復(fù)方新諾明趨于耐藥（均為16.7%）；D 群多殺性巴氏桿菌，對青霉素、鏈霉素、克林霉素、復(fù)方新諾明耐藥率較高，分別為100%、100%、66.7%、66.7%，對卡那霉素趨于耐藥（22.2%）；二者對氯霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星均敏感，未產(chǎn)生耐藥性（表4）。

表4 21 株多殺性巴氏桿菌分離株耐藥統(tǒng)計結(jié)果

3 討論

多殺性巴氏桿菌是引起綿羊及山羊呼吸道疾病的常見病原，綿羊比山羊、幼齡羊比成年對其更易感[11]。據(jù)不完全統(tǒng)計，近3 年呼倫貝爾市羊巴氏桿菌病累計發(fā)生70 余起，給養(yǎng)殖業(yè)造成很大經(jīng)濟損失，因此定期進行預(yù)防接種，增強機體對該病的特異性免疫力，是防控巴氏桿菌病最有效、最直接的方法。由于多殺性巴氏桿菌存在多種血清群，且各血清群之間大多無交叉免疫原性，因此建立分子生物學(xué)診斷方法，對于調(diào)查確定本地區(qū)流行的莢膜血清群、研制針對性血清群疫苗、減少經(jīng)濟損失十分必要。本研究建立了分子生物學(xué)診斷方法，利用雙重PCR，對呼倫貝爾市羊源多殺性沙門氏桿菌進行莢膜血清群分子流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果從35份疑似病料中分離出21 株 B 群、D 群多殺性巴氏桿菌，未分離出其他血清群，說明該市流行的羊源多殺性巴氏桿菌以B 群、D 群為主。經(jīng)序列比對及遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，B 群、D 群菌株分別與CP023305、KY825087 同源性最高，達到100%，與其他地區(qū)提交序列同源性也較高，在97%～100%之間，說明不同地區(qū)間的菌株基因變異并不明顯。對21 株分離菌株進行藥物敏感性分析，發(fā)現(xiàn)分離菌株對青霉素、鏈霉素、克林霉素、復(fù)方新諾明及卡那霉素等常見抗菌藥產(chǎn)生了不同程度的耐藥，其中對青霉素、鏈霉素耐藥水平最高，B 群、D 群分別達到66.7%、100%?？咕幠退幮缘漠a(chǎn)生與農(nóng)牧民長期濫用抗菌藥物、飼料中任意添加抗菌藥物、出現(xiàn)疫病隨意加大藥物劑量等不無關(guān)系。因此，建議相關(guān)部門加大抗菌藥物的生產(chǎn)和使用管理力度，同時呼吁養(yǎng)殖場（戶）在日常飼養(yǎng)管理用藥時，減少對抗菌藥物的濫用和依賴，尤其是青、鏈霉素；駐場獸醫(yī)及鄉(xiāng)村獸醫(yī)在疾病治療時，應(yīng)因地制宜，優(yōu)化用藥方案，科學(xué)選擇抗菌藥物，避免反復(fù)使用同種藥物，防止耐藥菌株的產(chǎn)生與增加。本研究不僅為研制相應(yīng)的疫苗及科學(xué)防治巴氏桿菌病提供了依據(jù)，也對多殺性巴氏桿菌病流行病學(xué)監(jiān)測和基因多樣性研究奠定了基礎(chǔ)，并且找到了針對呼倫貝爾市流行的莢膜血清群敏感藥物，為該市羊巴氏桿菌病防控提供了有效的技術(shù)支撐。