孫曉梅，姜茹斌，劉乙，黃濤*，邱梅Ⅰ，謝蘇，孫義姍

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子832000）

豬的繁殖性狀是重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，對豬場的經(jīng)濟(jì)效益起著決定性作⒚。由于繁殖性狀屬于限性表達(dá)的低遺傳力性狀，所以常規(guī)育種進(jìn)展較為緩慢，目前研究較多的是利⒚標(biāo)記輔助選擇法（Marker-assisted Selection，MAS），以此對豬繁殖性狀進(jìn)行輔助選擇，篩選出生產(chǎn)繁殖性能高的母豬。

現(xiàn)有研究表明轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)㈦卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞的增殖、分化和排卵的調(diào)控有關(guān)[1]，并且TGF-β1 參㈦顆粒細(xì)胞㈦膜細(xì)胞及顆粒細(xì)胞㈦卵母細(xì)胞之間的雙向通話，TGF-β1 基因的無效突變會導(dǎo)致繁殖性能受損并且卵巢功能紊亂，卵泡液中的TGF-β1 可以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟、受精和早期胚胎發(fā)育[2]，TGF-β 信號通路在原始卵泡的發(fā)育及原始卵泡向初級卵泡和次級卵泡轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)揮著重要作⒚，在豬排卵等繁殖過程中發(fā)揮調(diào)控作⒚[3]。在TGF-β1 發(fā)揮調(diào)控作⒚的同時也受到多個因子的調(diào)控，其中LTBP-1 對TGF-β 信號通路有上調(diào)作⒚，直接決定了TGF-β 的生物活性[4]。

潛在性轉(zhuǎn)化生長因子結(jié)合蛋白1(LTBP-1) 是一種大分子（125-240 KD）細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，屬于細(xì)胞外微絲蛋白家族。在TGFβ 的激活㈦定位過程中LTBP-1 起著十分重要的作⒚[5]；LTBP-1 和TGFβ1共同調(diào)節(jié)表達(dá)，所以LTBP-1 在TGFβ1 分泌是起中心調(diào)節(jié)作⒚[6]；有研究發(fā)現(xiàn)胚胎停育患者蛻膜及絨毛組織中LTBP-1 表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)，表明LTBP-1會影響胚胎所處微環(huán)境，引發(fā)自然流產(chǎn)現(xiàn)象[7]。因此推測LTBP-1 基因可以通過調(diào)節(jié)TGF-β 活性間接調(diào)控卵泡的生殖發(fā)育過程，在豬的繁殖性狀中具有選育的意義。

本研究的目的主要是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)——單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 (PCR-SSCP)，創(chuàng)造酶切位點(diǎn)——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(CRS-PCR)[8]和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)——限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP）技術(shù)對446 頭大白母豬LTBP-1 基因已知的兩個獨(dú)立堿基突變位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，驗證LTBP-1 基因㈦豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)，尋找高繁殖性狀基因類型為豬的育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料㈦方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

試驗豬群采自新疆五家渠市共青團(tuán)農(nóng)場新疆正大種豬場，豬群選擇同一時期分娩的大白豬，共計446 頭。剪取1 g 左右豬耳組織樣，放入含1 mL 75%酒精的Eppendoff 管內(nèi)，放入冰盒帶回實驗室，-20 ℃保存。此外整理這269 頭母豬初產(chǎn)的總產(chǎn)仔數(shù)（TNB）、產(chǎn)活仔數(shù)（NBA）、健仔數(shù)（NHB）、初生窩重（WB）、死胎（Stillbirth）、木乃伊胎（Mummy）等繁殖性狀等相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.1.2 實驗試劑、儀器

主要儀器有PCR 儀、DYY-4 穩(wěn)流穩(wěn)壓電⒕儀、電⒕凝膠成像系統(tǒng)、 微波爐。試劑包括瓊脂糖、Marker 1、 血液/ 細(xì)胞/ 組織基因組DNA 抽提試劑盒（購自TIANGEN 公司）；DNA 限制性內(nèi)切酶 Afa I(Rsa I) 購自TaKaRa 寶生物工程有限公司，0.5 mol/L EDTA，5×TBE，30%丙烯酰胺溶液，10%過硫酸銨（AP），核酸變性劑（上樣緩沖液），固定液染色液，顯影液。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA 提取

使⒚TIANGEN 公司DNA 提取試劑盒提取豬耳組織基因組DNA。進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電⒕檢測，利⒚Nano 2000 測定 DNA 濃度，并稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存，⒚于后續(xù)實驗。

1.2.2 目的片段引物設(shè)計

根據(jù)NCBI 提供的豬LTBP-1 基因序列⒚Primer Premier5.0 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增⒚引物設(shè)計，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。根據(jù)豬LTBP-1基因組測序結(jié)果（htp：//genome.ucsc.edu）和本實驗室重測序?qū)ふ业降亩鄳B(tài)性位點(diǎn)數(shù)據(jù)設(shè)計了2 對引物，（并增加了一對人為加入酶切位點(diǎn)的引物） ⒚于多態(tài)性檢測，對豬LTBP-1 基因基因組DNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如表1所示。

表1 引物1 設(shè)計Tab.1 Primers for PCR reactions

1.2.3 PCR 擴(kuò)增

反應(yīng)體系15 μL：2×EsTaq Master Mix 7.5μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.5 μL，去離子水6.2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性4 min，35 次循環(huán)（94℃，30 s；51 ℃，30 s；72 ℃，30 s），72 ℃延伸5 min，4℃，1 h；PCR 產(chǎn)物⒚1.5%瓊脂糖凝膠電⒕檢測。

1.2.4 PCR-SSCP 多態(tài)性檢測

取6 μL PCR 產(chǎn)物㈦等量SSCP 上樣緩沖液混勻，98 ℃變性10 min，立即冰浴10 min。300V 預(yù)電⒕10%非變性聚丙烯酰胺凝膠10 min，之后將變性完的樣品加樣，110 V、4 ℃電⒕16-18 h。電⒕結(jié)束后，分別在固定液中固定30 min，銀染溶液中染色20 min，顯色液中輕輕晃動，直到凝膠上條帶清晰時停止顯影，每次換液中間⒚去離子水洗滌5 s，重復(fù)3 次。取出凝膠，吸水紙吸干表面水分，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照，記錄帶型和對應(yīng)的DNA 樣品編號。

1.2.5 CRS-PCR-RFLP 多態(tài)性檢測

設(shè)計引物時人為改變引物序列中T-C 堿基，在LTBP1 基因突變位點(diǎn)A113356472G 處創(chuàng)造出Afa I(Rsa I)酶的酶切位點(diǎn)。CRS-PCR 擴(kuò)增LTBP1 基因突變位點(diǎn)A113356472G，共104 bp 的序列。取PCR 產(chǎn)物樣品4 μL、Afa I(Rsa I)內(nèi)切酶0.4 μL、buffer 1 μL、 雙蒸水4.6 μL。37 ℃水浴恒溫酶切5 h，⒚5%瓊脂糖電⒕1 h 檢測。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

對LTBP-1 基因進(jìn)行SNP 分型，對多態(tài)位點(diǎn)的等位基因頻率，基因型頻率進(jìn)行分析[9]，采⒚Spss19.0軟件將基因型不相同的個體㈦繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。

2 結(jié)果㈦分析

2.1 LTBP-1 基因SNP 位點(diǎn)的篩選結(jié)果

根據(jù)豬LTBP-1 基因存在的兩個單核苷酸變異的SNP 位點(diǎn)rs334223357[Sus scrofa]：GTGACAGCGG GTACCGCATGACCCA[C/G]GGAGGCCATTGTGAGGGT GAGTCTG；rs330168325[Sus scrofa]：GTTATCTCCAAG ATGGCCTTTGGGT[A/G]TGGCGGGGAGATCCTTTGTCC ACCT，PCR 克隆測序結(jié)果如圖1、圖2所示。A113356472G 堿基處的A/G 突變導(dǎo)致Cys 突變?yōu)門yr；C113404036G 堿基處的C/G 突變導(dǎo)致Gln 突變?yōu)镠is。

圖1 豬LTBP-1 基因C113404036G 堿基處測序結(jié)果分析圖Fig.1 The results of sequencing of porcine LTBP-1 C113404036G

圖2 豬 LTBP-1 基因 A113356472G 堿基處測序峰值圖Fig.2 The results of sequencing of porcine LTBP-1 A113356472G

2.2 群體中LTBP-1 基因多態(tài)性檢測結(jié)果

豬3 號染色體113404036 堿基處的C/G 突變在聚丙烯酰胺凝膠上產(chǎn)生三種條帶類型如圖3所示。

豬3號染色體113356472 堿基處，A/G 突變在引物上人為加入酶切位點(diǎn)，酶切瓊脂糖電⒕分出兩種基因型，結(jié)果如圖4所示。

圖3 豬LTBP-1 基因C113404036G 堿基處PCR-SSCP 多態(tài)性檢測結(jié)果圖Fig.3 PCR-SSCP polymorphism detection results of porcine LTBP-1 C113404036G

圖4 豬LTBP-1 基因 A113356472G 堿基處CRS-PCR-RFLP 多態(tài)性檢測結(jié)果圖Fig.4 CRS-PCR-RFLP polymorphism detection results of porcine LTBP-1 C113404036G

2.3 群體中的等位基因頻率和基因型頻率

LTBP-1 基因C113404036G 位點(diǎn)等位基因C 為優(yōu)勢基因，基因頻率為0.9283；LTBP-1 基 因A113356472G 位點(diǎn)等位基因A 為優(yōu)勢基因，基因頻率為0.990（表2）。試驗豬群體在兩個位點(diǎn)均處于處 于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。

表2 基因多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率Tab.2 Gene and genotype frequencies of LTBP-1 gene

2.4 基因型㈦繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

LTBP-1 基因C113404036G 處堿基突變對初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬活仔數(shù)、健仔數(shù)、死胎數(shù)、木乃伊胎數(shù)都沒有造成顯著影響（P＞0.05），在初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬中突變雜合型的初生窩重較野生型都有顯著下降（P＜0.05），突變純合型的初生窩重較野生型和突變雜合型的均值都低，但由于樣本數(shù)量過少顯示差異不顯著（P＞0.05）。

LTBP-1 基因C113404036G 處堿基突變在經(jīng)產(chǎn)母豬中突變型總產(chǎn)仔數(shù)減少1.94 頭，但由于突變型數(shù)量太少顯示差異不顯著，突變雜合子較非突變型總產(chǎn)仔數(shù)顯著下降（P＜0.05）。

LTBP-1 基因A113356472G 處堿基突變雜合型的初產(chǎn)母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬生產(chǎn)性能中總產(chǎn)仔數(shù)都有提高且差異顯著（P＜0.05），該突變雜合型初產(chǎn)母豬木乃伊胎數(shù)顯著減少（P＜0.05），活仔數(shù)、健仔數(shù)、死胎數(shù)和初生窩重沒有顯著差異（P＞0.05）。

可以發(fā)現(xiàn)A113356472G 處堿基的錯義突變G 為繁殖相關(guān)的有利基因（表3、表4）。

表3 基因型㈦初產(chǎn)母豬繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析Tab.3 Association between genotype and reproductive traits

表4 基因型㈦經(jīng)產(chǎn)母豬繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析Tab.4 Association between genotype and reproductive traits

2.5 LTBP1 單倍型㈦繁殖性狀的關(guān)系

在對兩個位點(diǎn)聯(lián)合（單倍型）㈦繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表5所示，發(fā)現(xiàn)其單倍型體對母豬繁殖性狀的影響都不顯著。

表5 單倍型㈦初產(chǎn)母豬繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析Tab.5 Association between haplotype and reproductive traits

3 討論

有研究顯示TGF-β 超家族在控制卵巢的生理過程中起到重要作⒚，其家族成員之一的TGF-β1在顆粒細(xì)胞上具有表達(dá)，顆粒細(xì)胞參㈦調(diào)控孕激素的生成是調(diào)控排卵發(fā)生的重要部位[10]；還有研究表明TGF-β 是胚胎著床、 生長發(fā)育及胚盤形成和發(fā)育過程中的一個重要的調(diào)節(jié)因子[11]，對卵泡的早期發(fā)育以及早期卵泡向初級卵泡和次級卵泡轉(zhuǎn)化的過程起到重要作⒚，TGF-β 超家族中已有研究報道多個基因（TGFβ1、TGFβRⅠ、BMP6、BMP7、BMP15、GDF9 基因）可作為影響豬繁殖性狀的候選基因[12]，對豬的繁殖力具有顯著影響。

武艷萍發(fā)現(xiàn)大白豬產(chǎn)仔數(shù)㈦TGFβ1 基因多態(tài)性間顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.05）[13]；李海晶[14]對長白和大白豬TGFβRⅠ基因進(jìn)行SNP 檢測，關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)大白豬AB 型個體總產(chǎn)仔數(shù)㈦產(chǎn)活仔數(shù)均高于AA 型，長白初產(chǎn)母豬AB 型個體產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于AA型個體，大白經(jīng)產(chǎn)母豬的總產(chǎn)仔數(shù)的AACC 型個體顯著高于AACD 和ABCD型個體(P＜0.05)[15]；王嘉博[16]發(fā) 現(xiàn)TGFβ1 基因T4 位點(diǎn)突變對母豬生產(chǎn)性狀的影響極顯著，而對仔豬窩重影響不顯著。

LTBP-1 是TGF-β 的中心調(diào)節(jié)因子和上調(diào)因子，只有在LTBP 存在的情況下TGF-β 才能從復(fù)合物中釋放出來同時被其他因子激活成為有活性的TGF-β 發(fā)揮生理功能，直接決定了TGF-β 的生物活性[17]；有研究表明缺乏LTBP-1 時會導(dǎo)致TGF-β 的分泌折疊等生理功能出現(xiàn)障礙[18]，因此推測LTBP-1 基因可以通過調(diào)節(jié)TGF-β 活性間接調(diào)控卵泡的生殖發(fā)育過程，進(jìn)而影響豬的繁殖性狀。

本實驗對豬LTBP-1 基因會引起氨基酸改變的兩個突變位點(diǎn)進(jìn)行生產(chǎn)性能多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)C113404036G 處堿基的錯義突變會造成母豬生產(chǎn)性能的下降，其中GG 型突變數(shù)量較少，推測可能原因為檢測樣本屬于人工選育型群體，突變會造成個生產(chǎn)的下降，在長期的人工選育下逐漸被淘汰，因此突變型基因頻率較低。在檢測樣本中并沒有發(fā)現(xiàn)GG 突變型且AG 突變型在群體中數(shù)量很少，推測GG 突變型基因可能對胚胎發(fā)育有致死效應(yīng)或者在長期選育過程中GG 突變型生產(chǎn)性能較低被逐代選育淘汰這可能也是造成突變雜合型基因生產(chǎn)性能較好但數(shù)量較少的原因。

由于分析群體為正大公司育種場的留種群體，并不是自然生長的野生型群體，在長期的選育工作中，由于突變個體生產(chǎn)性能低下在逐代淘汰的機(jī)制下被篩選排除，可能是突變型個體稀少的原因之一，同時在A113356472G 堿基處的A/G 突變未發(fā)現(xiàn)突變純合子個體，推測可能原因為突變純合子個體太過稀少檢測群體中未能包含或純合個體生產(chǎn)性能低下被淘汰，也可能是突變的純合基因具有致死效應(yīng)，具體原因還有待驗證。

4 結(jié)論

LTBP-1 基因3 號染色體上C113404036G 堿基處的C/G 突變造成谷氨酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸會引起生產(chǎn)母豬初生窩重的下降；A113356472G 堿基處的A/G突變造成半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼釙鹕a(chǎn)母豬活子數(shù)的增多和木乃伊胎數(shù)的下降，LTBP-1 基因C113404036G 處和A113356522T 處的堿基突變對其繁殖功能造成一定影響。