呂波，朱新鋒，蔡常春，鄭小林

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 肝膽胰外科 ，湖北 武漢 430014）

膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）起源于肝臟或膽道內(nèi)的上皮細(xì)胞。英美發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，但全球發(fā)病率持續(xù)增加，大多數(shù)CCA患者診斷時(shí)處于晚期，對(duì)常見(jiàn)化療藥物易產(chǎn)生耐藥性而導(dǎo)致預(yù)后不佳[1-2]。CCA發(fā)病與寄生蟲(chóng)感染、原發(fā)性膽道硬化和膽道畸形等危險(xiǎn)因素相關(guān)[3]。CCA的發(fā)生是個(gè)涉及遺傳改變和環(huán)境因素相互作用的復(fù)雜過(guò)程[4]，多種致癌或抑癌基因的突變被認(rèn)為參與CCA發(fā)生和進(jìn)展[5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的RNA分子，其異常表達(dá)與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病密切相關(guān)[6-8]。lncRNA CBR3-AS1（也稱PlncRNA1）最早發(fā)現(xiàn)其在前列腺癌組織中上調(diào)并調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡[9]。然而，lncRNA CBR3-AS1在CCA中的功能尚未完全闡明。本研究旨在探討CCA患者癌組織中l(wèi)ncRNA CBR3-AS1表達(dá)狀態(tài)及其與預(yù)后的關(guān)系，并探討其對(duì)CCA細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本收集

本研究收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院肝膽胰外科于2012年1月—2014年1月期間手術(shù)切除的CCA患者組織標(biāo)本58例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 患者經(jīng)病理診斷為原發(fā)性CCA；⑵ 除CCA外不存在其他部位原發(fā)性惡性腫瘤；⑶ 術(shù)前患者未經(jīng)過(guò)任何放化療或生物治療；⑷ 具有完整的病例和隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合上述標(biāo)準(zhǔn)者。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 臨床資料收集和隨訪

收集患者臨床資料和隨訪信息?；颊呖偵鏁r(shí)間為手術(shù)后出院第1天到死亡時(shí)間或隨訪截止時(shí)間。通過(guò)電話或門(mén)診隨訪，每3個(gè)月隨訪1次，行肝臟彩超、腹部CT及腫瘤標(biāo)志物檢查，隨訪內(nèi)容包括患者復(fù)發(fā)及死亡情況，隨訪截止至2019年1月，最長(zhǎng)隨訪時(shí)間6年，共2例失訪。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

CCA細(xì)胞系（RBE和QBC939）和正常人膽管上皮細(xì)胞系（HIBE）購(gòu)自日本生物樣本保存庫(kù)。lncRNA CBR3-AS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、陰性對(duì)照質(zhì)粒及l(fā)ncRNA CBR3-AS1敲降質(zhì)粒均由上海吉瑪生物科技有限公司合成。MTT試劑盒、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，RIPA細(xì)胞裂解液及BCA試劑盒購(gòu)于北京碧云天公司，TRIzol提取試劑、一步法cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green real-time PCR MasterMix購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司，ABI-7500平臺(tái)。LipofectamineTM3000 購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Invitrogen公司，qPCR引物由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 所有細(xì)胞系在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 組織及細(xì)胞分組 將CCA細(xì)胞系RBE在六孔板上長(zhǎng)至匯合80%以上時(shí)，按LipofectamineTM3000說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染lncRNA CBR3-AS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（過(guò)表達(dá)組）、陰性對(duì)照質(zhì)粒（對(duì)照組）及l(fā)ncRNA CBR3-AS1沉默表達(dá)質(zhì)粒（沉默組）。

1.4.3 細(xì)胞活力檢測(cè) 使用3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）細(xì)胞增殖/活力測(cè)定試劑盒根據(jù)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞活力。測(cè)量并記錄570 nm波長(zhǎng)下每孔的吸光度A570nm，細(xì)胞活力計(jì)算公式=（A570nm樣本/A570nm對(duì)照）×100%。

1.4.4 細(xì)胞侵襲測(cè)定 使用具有8 mm聚碳酸酯核孔過(guò)濾器Transwell室行侵襲測(cè)定。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞種植到用40 μL Matrigel預(yù)涂覆上室中，用200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基孵育，且下室用600 μL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基填充。多聚甲醛用于細(xì)胞固定，0.1%結(jié)晶紫用于染色，37 ℃孵育24 h后計(jì)數(shù)黏附在下表面的細(xì)胞數(shù)目。

1.4.5 實(shí) 時(shí) 定 量PCR（qRT-PCR） 使 用TRIzol從腫瘤標(biāo)本或細(xì)胞系中提取總RNA，并使用SuperScriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用SYBR Premix Ex Taq TM II試 劑 盒 在ABI-7500平臺(tái)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，GAPDH為內(nèi)參。lncRNA CBR3-AS1表達(dá)采用以下引物測(cè)定：lncRNA CBR3-AS1引物序列，正向：5'-CAG TGG GGA ACT CTG ACT CG-3'， 反 向5'-GTG CCT GGT GCT CTC TTA CC-3'。GAPDH引物序列，正向：5'-GTC AAC GGA TTT GGT CTG TAT T-3'，反向：5'-AGT CTT CTG GGT GGC AGT GAT-3'。采用2-ΔΔCt法定量，計(jì)算lncRNA CBR3-AS1相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA CBR3-AS1在CCA組織與細(xì)胞系中的表達(dá)

lncRNA CBR3-AS1在CCA組織中表達(dá)量明顯高于癌旁組織[（8.2±1.4）vs.（1.3±0.4），P＜0.01]（圖1A）；CCA細(xì)胞系RBE和QBC939中CBR3-AS1平均表達(dá)水明顯高于正常膽管上皮細(xì)胞系HIBE（均P＜0.01）（圖1B）。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)lncRNA CBR3-AS1表達(dá) Figure1 Expressions of lncRNA CBR3-AS1 determined by qRT-PCR

2.2 lncRNA CBR3-AS1表達(dá)與CCA患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)lncRNA CBR3-AS1表達(dá)相對(duì)水平中位值，將58例CCA患者分為lncRNA CBR3-AS1高表達(dá)組30例和lncRNA CBR3-AS1低表達(dá)組28例。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，lncRNA CBR3-AS1表達(dá)與年齡、腫瘤部位、血管浸潤(rùn)、分化狀態(tài)、HBV感染和血清腫瘤標(biāo)志物CEA和CA19-9均無(wú)明顯關(guān)系（均P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.030）、TNM分期（P=0.007）和術(shù)后復(fù)發(fā)（P=0.001）明顯有關(guān)（表1）。

表1 lncRNA CBR3-AS1表達(dá)與CCA患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系[n（%）]Table1 The relations of lncRNA CBR3-AS1 expression with the clinicopathologic characteristics of cholangiocarcinoma patients [n (%)]

2.3 lncRNA CBR3-AS1高表達(dá)與CCA患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析示，lncRNA CBR3-AS1高表達(dá)組CCA患者總生存率明顯低于lncRNA CBR3-AS1低表達(dá)組CCA患者（P=0.004）（圖2）。

圖2 不同lncRNA CBR3-AS1表達(dá)水平CCA患者的生存曲線Figure2 The survival curves of CCA patients with different lncRNA CBR3-AS1 expression levels

2.4 影響CCA患者總生存率的危險(xiǎn)因素分析

單因素分析顯，示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)、TNM分期、術(shù)后復(fù)發(fā)和CBR3-AS1表達(dá)是影響總生存率的危險(xiǎn)因素（均P＜0.01），多因素分析顯示，TNM分期（P=0.014）和lncRNA CBR3-AS1表達(dá)（P=0.020）是影響CCA患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表2）。

2.5 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)及l(fā)ncRNA CBR3-AS1對(duì)CCA細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染后，沉默組lncRNA CBR3-AS1表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）；過(guò)表達(dá)組lncRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）（圖3）。轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖活力明顯高于對(duì)照組；沉默組細(xì)胞增殖活力明顯低于對(duì)照組（圖4）。

表2 影響CCA患者總生存率的危險(xiǎn)因素分析Table2 Analysis of risk factors for overall survival of CCA patients

圖3 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)Figure3 Transfection efficiency measurement

圖4 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)Figure4 Cell proliferation assay

2.6 CBR3-AS1在體外調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲

200倍視野下，過(guò)表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)為（340±23）個(gè)，沉默組侵襲細(xì)胞數(shù)為（115±9）個(gè)，對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)為（203±17）個(gè)；過(guò)表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組（P＜0.01），沉默組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組（P＜0.01）（圖5）。

3 討 論

CCA是第二常見(jiàn)的原發(fā)性肝腫瘤[9]。CCA早期診斷不易，大多數(shù)患者診斷時(shí)處于晚期而失去最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，導(dǎo)致患者5年生存率低至10%，因此，鑒別CCA預(yù)后相關(guān)分子標(biāo)志物對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要[10]。

全基因組測(cè)序技術(shù)發(fā)展促進(jìn)了各種非編碼RNA（no coding RNA，ncRNA）的發(fā)現(xiàn)，其中大量非編碼RNA被證實(shí)參與癌癥發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[11]，對(duì)多種人類癌癥具有診斷和預(yù)后價(jià)值[12]。lncRNA是一種新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA分子，涉及細(xì)胞發(fā)育和分化、轉(zhuǎn)錄和翻譯及代謝調(diào)節(jié)[13]。越來(lái)越多的研究表明lncRNA可作為致癌基因或腫瘤抑制基因參與包括胃癌、肝細(xì)胞癌、肺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤進(jìn)展[14-16]。最近研究認(rèn)為lncRNA也參與CCA發(fā)生和進(jìn)展：如NEAT-1過(guò)表達(dá)有助于CCA細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，同時(shí)使CCA細(xì)胞對(duì)化療藥物吉西他濱更敏感[17]，CCAT1被證實(shí)為CCA患者不良預(yù)后標(biāo)志物[18]，而AFAP1-AS1可作為CCA細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移啟動(dòng)因子[19]。

lncRNA CBR3-AS1是21號(hào)染色體上的蛋白質(zhì)編碼基因，位于羰基還原酶3（CBR3）的反義區(qū)域，其可在體外促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲[20]，lncRNA CBR3-AS1在前列腺癌[21]和食道癌[22]的癌組織中過(guò)表達(dá)且體外調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)CCA癌旁組織和正常細(xì)胞系比較，lncRNA CBR3-AS1在CCA組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào)，lncRNA CBR3-AS1高表達(dá)與較差的總生存率相關(guān)。單因素和多因素分析顯示，lncRNA CBR3-AS1是CCA患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。上述結(jié)果表明lncRNA CBR3-AS1可能參與CCA腫瘤進(jìn)展，并可作為潛在預(yù)后標(biāo)志物。近年來(lái)研究報(bào)道多個(gè)lncRNA分子可作為預(yù)測(cè)CCA不良預(yù)后的分子，最新研究報(bào)道lncRNA SPRY4-IT1可在CCA中發(fā)揮癌基因作用，促進(jìn)腫瘤發(fā)展且與CCA不良預(yù)后相關(guān)，是新的預(yù)后生物標(biāo)志物[23]；而lncRNANEF下調(diào)與CCA不良預(yù)后相關(guān)，并發(fā)揮抑癌基因作用[24]。

本研究通過(guò)功能喪失和獲得實(shí)驗(yàn)證明lncRNA CBR3-AS1在CCA腫瘤進(jìn)展中的功能。lncRNA CBR3-AS1敲降后可顯著抑制體外CCA細(xì)胞增殖活力；反之，lncRNA CBR3-AS1過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)體外CCA細(xì)胞增殖。CBR3-AS1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)CCA細(xì)胞侵襲。反之，CBR3-AS1敲降后可抑制CCA細(xì)胞侵襲，這與骨肉瘤[25]中的報(bào)道類似，在骨肉瘤細(xì)胞系中，敲降lncRNA CBR3-AS1可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并誘導(dǎo)凋亡[25]。研究結(jié)果提示lncRNA CBR3-AS1作為致癌lncRNA分子在CCA發(fā)生和進(jìn)展中可能起重要作用，這可能解釋了CCA lncRNA CBR3-AS1高表達(dá)的患者預(yù)后差的原因。盡管如此，lncRNA CBR3-AS1靶基因和致癌潛在機(jī)制尚值得更進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CBR3-AS1在CCA組織和細(xì)胞系中上調(diào)表達(dá)，與CCA患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。lncRNA CBR3-AS1可調(diào)節(jié)CCA細(xì)胞增殖和侵襲，可能是CCA一種新的預(yù)后分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。