鄭文杰　潘清青　童旭峰　潘麗芹

摘要采用不同濃度的Zn2+.Cu2+溶液處理白三葉種子，研究Zn2+、Cu2*對(duì)白三葉種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，旨在為白三葉在Zn2+.Cu2+污染土壤中的種植適宜性提供參考。結(jié)果表明，當(dāng)Zn2*濃度達(dá)到125mg/L、Cu2+濃度為60mg/L及以上時(shí)，白三葉種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)均受到顯著抑制，對(duì)發(fā)芽指數(shù)無(wú)明顯影響，但卻顯著影響種子的活力指數(shù)，并顯著抑制了幼苗胚根、胚芽以及生物量的增加，且濃度越高抑制作用越明顯，對(duì)胚根的抑制作用明顯強(qiáng)于胚芽;白三葉種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)對(duì)Zn2+的耐受力大于Cu2+，不適宜在Zn2+濃度達(dá)125mg/L及以上的土壤中種植，而Cu2+污染的限制濃度為60mg/L、且250mg/L可認(rèn)為是白三葉幼苗的致死劑量。

關(guān)鍵詞 Zn2*;Cu2*;白三葉;脅迫;重金屬離子

中圖分類號(hào) S762.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-5739（2019）07-0121-02

近年來(lái)，土壤重金屬污染問(wèn)題日益嚴(yán)重”。在我國(guó)，有1/6左右叫的耕地土壤受到重金屬污染。重金屬污染因?qū)ν寥赖挠绊懗掷m(xù)時(shí)間長(zhǎng)、污染隱蔽以及不可逆性等原因而被人們廣為關(guān)注。土壤中的重金屬嚴(yán)重影響著植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、生理生化及礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)代謝過(guò)程B-61。Zn2+、Cu2+是植物體內(nèi)不可或缺的微量元素之-7-8，而過(guò)量的Zn2+、Cu2會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生危害，同時(shí)，經(jīng)食物鏈富集于人體當(dāng)中，會(huì)擾亂人體的正常機(jī)能和新陳代謝，甚至導(dǎo)致重金屬中毒。白三葉（Trifolium?repens）又名白車軸草，為多年生草本植物，其植株低矮抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣、再生性好，可有效防止水土流失，被廣泛應(yīng)用于城市綠化和水土保持。目前，對(duì)白三葉的研究多為從生理生態(tài)角度研究其對(duì)環(huán)境脅迫的耐性19-10]，而白三葉對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)則研究甚少。因此，重金屬脅迫對(duì)白三葉生理生態(tài)的影響具有一定的研究?jī)r(jià)值。本研究以白三葉種子為研究材料，模擬不同濃度的Zn2+Cu2+脅迫，探討Zn2+、Cu2對(duì)白三葉種子萌發(fā)的影響，旨在為白三葉在鋅、銅污染土壤中的種植適宜性提供參考，并進(jìn)一步探討白三葉作為土壤重金屬污染修復(fù)植物的可能性。

1材料與方法

1.1材料與試劑

白三葉種子網(wǎng)購(gòu)于江蘇花草種業(yè)公司。ZnSO4.7H2O、無(wú)水硫酸銅購(gòu)自杭州寶成生物技術(shù)有限公司，含量≥99.5%，分析純?cè)噭〢R級(jí)。

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2016年12月在臺(tái)州科技職業(yè)學(xué)院園藝植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，將重金屬Zn2+Cu2+濃度分別設(shè)為30、60、125、250mg/L，試驗(yàn)設(shè)9個(gè)處理，分別為Zn2+30mg/L（A1）、60mg/L（A2）、125mg/L（A3）、250mg/L（A4）脅迫和Cu2+30mg/L（B.）.60mg/L（B2）、125mg/L（B）、250mg/L（B4）脅迫以及蒸餾水培養(yǎng)（CK）。

取大小均勻、健康飽滿的白三葉種子，用0.1%HgCl2浸泡5min，再用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈。培養(yǎng)皿滅菌后在底部鋪上直徑為11em的定性濾紙2層，分別滴加等量不同濃度的Zn2+、Cu2+溶液浸潤(rùn)濾紙，在培養(yǎng)皿內(nèi)均勻放入50粒種子。每個(gè)處理3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于溫度為25C相對(duì)濕度為75%的人工氣候箱中，設(shè)定光照時(shí)長(zhǎng)8h、光照強(qiáng)度為1150lx。觀察種子的發(fā)芽情況及幼苗的生長(zhǎng)狀況，并做好記錄。

1.3測(cè)定指標(biāo)

1.3.1種子萌發(fā)測(cè)定指標(biāo)。按照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)》（GB/T3543.4-1995），在處理第3天統(tǒng)計(jì)白三葉種子發(fā)芽勢(shì)，第7天測(cè)定發(fā)芽率。從發(fā)芽次日開(kāi)始，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)（以胚根突出種皮作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)），并始終保持濾紙濕潤(rùn)，連續(xù)測(cè)定7d，用于計(jì)算種子發(fā)芽的相關(guān)指標(biāo)。

發(fā)芽勢(shì)（%）=（7d內(nèi)種子的發(fā)芽數(shù)（種子數(shù)）x100%;發(fā)芽率（GP）（%）=（種子發(fā)芽數(shù)種子數(shù)）x100%;發(fā)芽指數(shù)（GI）=2GT/Dt;

活力指數(shù)（VI）=GlxS。

式中，GT為種子在t日的發(fā)芽數(shù);Dt為發(fā)芽天數(shù);S為發(fā)芽后第7天幼苗的長(zhǎng)度。

1.3.2幼苗形態(tài)指標(biāo)。脅迫12d時(shí)，測(cè)定幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)。株高、莖粗采用常規(guī)測(cè)量法，用卷尺測(cè)量株高，用游標(biāo)卡尺測(cè)量莖粗。生物量干重測(cè)定方法為用濾紙吸干幼苗表面的水分，每處理隨機(jī)選取生長(zhǎng)較為一致的幼苗50株，分地上部分、地下部分分別稱鮮重。生物量干重測(cè)定方法為將植株置于干燥箱中105C條件下烘15min，再于80C下烘至恒重后稱重"。

根冠比=根干重/地上部干重;

平均胚芽長(zhǎng)=選取的50顆種子胚芽長(zhǎng)的累加/50;平均胚根長(zhǎng)=選取的50顆種子胚根長(zhǎng)的累加/50。1.4數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)采用Excel2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.與統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用LSD法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1對(duì)白三葉種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)的影響

本研究中，不同濃度的Zn2+、Cu2+對(duì)白三葉種子的萌發(fā)有不同程度的影響（表1）。當(dāng)Zn2+濃度為3060mg/L時(shí)，種子的發(fā)芽率分別為81.4%和82.3%，稍低于對(duì)照（CK）的86.7%;而當(dāng)濃度高達(dá)125、250mg/L時(shí)，種子的萌發(fā)率僅分別為72.3%和70.2%，顯著低于對(duì)照（P<0.05），說(shuō)明較高濃度的Zn2對(duì)種子的萌發(fā)起到了一定的抑制作用。Cu2+對(duì)白三葉種子萌發(fā)的影響稍有不同。當(dāng)Cu2濃度為30mg/L時(shí)，種子發(fā)芽率為82.2%，與對(duì)照差別不大;當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到60mg/L及以上時(shí)，種子發(fā)芽率則顯著低于對(duì)照（P<0.05），表現(xiàn)出了明顯的抑制作用。Zn2和Cu2+脅迫對(duì)發(fā)芽勢(shì)的影響效果與發(fā)芽率基本相似。

2.2對(duì)白三葉種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

不同濃度Zn2+、Cu2脅迫對(duì)白三葉種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響如表1所示。從表中可以看出，種子發(fā)芽指數(shù)受重金屬離子脅迫的影響較小，而Zn2+、Cu2+脅迫對(duì)種子活力指數(shù)的影響較大，均顯著低于對(duì)照（P<0.05）。說(shuō)明這2種重金屬離子對(duì)于種子的萌發(fā)影響不大，而對(duì)于幼苗的生長(zhǎng)則具有較大影響，顯著抑制了植株的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。

2.3對(duì)白三葉幼苗胚芽、胚根生長(zhǎng)的影響

不同濃度Zn2+、Cu2+脅迫對(duì)白三葉幼苗胚芽胚根生長(zhǎng)的影響如表1所示。從表中可以看出，Zn2+脅迫對(duì)白三葉幼苗胚根的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用（P<0.05）。處理A1、A2的平均胚根長(zhǎng)分別為15.6、13.2mm，遠(yuǎn)低于對(duì)照（30.7mm）;處理A3、A4的幼苗平均胚根長(zhǎng)僅為5.8、5.2mm，可見(jiàn)隨著Zn2+濃度增大，根的生長(zhǎng)顯著受到抑制。Zn2+脅迫對(duì)幼苗胚芽的生長(zhǎng)亦具有抑制作用，處理A1、A2、A3、A4的幼苗平均胚芽長(zhǎng)依次為10.4、8.7、7.1、6.4mm，均低于對(duì)照（11.7mm）;當(dāng)濃度達(dá)到125mg/L及以上時(shí)，胚芽生長(zhǎng)顯著受到抑制。

Cu2+脅迫對(duì)白三葉胚根胚芽生長(zhǎng)具有更明顯的抑制作用，處理B，、B2、B3、B4的平均胚根長(zhǎng)分別為6.8、2.7、1.40mm，平均胚芽長(zhǎng)分別為5.6、3.5、1.1、0.2mm，均顯著低于對(duì)照;尤其當(dāng)濃度達(dá)到250mg/L時(shí)，幼苗停止生長(zhǎng)，且大多已失水黃化或枯死。

2.4對(duì)白三葉幼苗生物量及根冠比的影響

不同濃度Zn2+、Cu2+脅迫處理后12d后，測(cè)定50株幼苗的鮮重與千重，統(tǒng)計(jì)分析不同濃度對(duì)白三葉幼苗生物量及根冠比的影響，結(jié)果如表2所示。由表可知，與對(duì)照相比，不同濃度的Zn2脅迫對(duì)白三葉幼苗的鮮重、干重均具有顯著的抑制作用（P<0.05），其中處理A4影響最大。Zn2+脅迫對(duì)根冠比的影響稍有不同，處理AA2與對(duì)照相差不大;而處理A3、A4的根冠比僅為0.11、0.09，顯著低于對(duì)照（0.25）。說(shuō)明隨著Zn2+濃度的增加，對(duì)幼苗根系的抑制作用更加顯著.Cu2+脅迫對(duì)白三葉幼苗生長(zhǎng)的抑制作用更加明顯，尤其當(dāng)濃度達(dá)到250mg/L時(shí)，幼苗根系不再生長(zhǎng)，導(dǎo)致大多數(shù)植株枯死，無(wú)法進(jìn)行生物量及根冠比的統(tǒng)計(jì)與計(jì)算。本試驗(yàn)中，各處理根冠比均小于1，隨著離子濃度的增大，根冠比越來(lái)越小，表明重金屬離子濃度越高，對(duì)地下部根的抑制作用越大，而對(duì)地上部芽的抑制作用明顯小于根。

3結(jié)論與討論

種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)受重金屬的影響較大，因而可以作為檢測(cè)土壤重金屬污染的重要指標(biāo)四。本研究結(jié)果表明，不同濃度的Zn2+、Cu7脅迫對(duì)白三葉種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)均具有一定程度的影響，隨著濃度的增加，種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)受到的抑制作，用增強(qiáng)。當(dāng)Zn2*濃度為30、60mg/L時(shí)，對(duì)種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)影響不大;而當(dāng)Zn2*濃度達(dá)到125mg/L及以上時(shí)，則對(duì)白三葉的種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)起到了顯著的抑制作用。白三葉種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)對(duì)Cu2+更加敏感，Cu2脅迫抑制作用更加顯著。在試驗(yàn)5d之后，60mg/L及以上濃度Cu2+處理的幼苗根系不再伸長(zhǎng)，地上部分均出現(xiàn)不同程度的黃化;試驗(yàn)7d后，高濃度Cu2+處理的幼苗已大多枯死。這是因?yàn)镃u2*抑制了幼苗根系的生長(zhǎng)，從而影響整個(gè)植株的生長(zhǎng)。因此，本研究認(rèn)為，白三葉對(duì)Zn2+的耐受力大于Cu2+，不適宜在Zn2+濃度為125mg/L及以上的土壤中種植;而Cu2+污染的限制濃度為60mg/L，且250mg/L可認(rèn)為是白三葉幼苗的致死劑量。

用不同濃度的Zn2+、Cu2+處理白三葉種子時(shí)，均不同程度地抑制了種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，這與張春榮等31、張虹等叫低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的研究結(jié)果不一致，可能是由于不同植物對(duì)重金屬污染的敏感性存在差異。另外，這2種重金屬脅迫對(duì)種子的發(fā)芽指數(shù)無(wú)顯著影響，而對(duì)種子的活力指數(shù)影響非常顯著，不同濃度處理間差異較大。Zn2+、Cu2*處理對(duì)胚根、胚芽的生長(zhǎng)和生物量的增加均具有顯著的抑制作用，對(duì)幼苗胚根的毒害作用明顯強(qiáng)于對(duì)胚芽的毒害作用。這可能是因?yàn)楦诜N子萌發(fā)時(shí)最先突破種皮吸水，根系中重金屬累積量較大，且受脅迫時(shí)間也比胚芽長(zhǎng)5），因而更易遭到毒害，停止生長(zhǎng)。根系停止對(duì)水分及礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，進(jìn)而導(dǎo)致地上部分失綠黃化枯死。

4參考文獻(xiàn)

[1]黃長(zhǎng)干，梁英，盧向黃，等紫鴨跖草對(duì)銅鹽脅迫的生理反應(yīng)[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，34（5）：526-530.

[2]宋偉，陳百明，劉琳.中國(guó)耕地士壤重金屬污染概況[J].水土保持研究，2013，20（2）：293-298.

[3]劉曦，陳陽(yáng).土壤污染對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J].科技與生活，2012，19（1）：209-210

[4]文曉慧.重金屬脅迫對(duì)植物的毒害作用[J].農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2012，2（11）：20-22

[5]王利寶，朱寧華，鄂建華，等.重金屬對(duì)樟樹、欒樹幼苗生長(zhǎng)的影響[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（2）：44-47.

[6]袁可能.植物營(yíng)養(yǎng)元素的土壤化學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，1983.

[7]鄭春苗，萬(wàn)力，王焰新，等中國(guó)地下水科學(xué)的機(jī)遇與挑戰(zhàn)[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

[8]王浩，陸垂裕，秦大庸，等.地下水?dāng)?shù)值計(jì)算與應(yīng)用研究進(jìn)展綜述[J].地學(xué)前緣，2010，17（6）：1-12.

[9]彭丹丹，王曉娟，李州等.亞精胺對(duì)PEG滲透脅迫下白三葉種子萌發(fā)及幼苗抗旱效應(yīng)的影響[J].草業(yè)科學(xué)，2016，33（9）：1739-1746.

[10]潘麗芹，韋海忠，張浩，等殼聚糖對(duì)鹽脅迫下白三葉種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的緩解作用[J].分子植物育種，2018，16（11）：3740-3744.

[11]鄭光華.種子活力的原理及其應(yīng)用，植物生理生化進(jìn)展[M].北京：科學(xué)出版社，1986.

[12]李偉強(qiáng)，毛任釗，劉小京脅迫時(shí)間與非毒性離子對(duì)重金屬抑制擬南芥種子發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，16（10）：1943-1947.

[13]張春榮，李紅，夏立江，等.鎘鋅對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2005，20（1）：96-99.

[14]張虹，劉杰，郭俊明，等.重金屬銅離子鋅離子脅迫對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（24）：11487-11488.

[15]梅麗娜，袁慶華，姚拓，等.不同品種苜蓿芽期對(duì)重金屬鎘的耐性研究[J].作物雜志，2010（2）：15-18.