曾 祺，張志國*

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟南 250353）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）由于其優(yōu)異的營養(yǎng)學(xué)特性與加工特性，被廣泛運用于現(xiàn)代食品工業(yè)中[1]。SPI主要由β-伴大豆球蛋白（7S）和大豆球蛋白組成（11S）[2]，這些蛋白通過氫鍵與分子內(nèi)二硫鍵形成了穩(wěn)定的球型結(jié)構(gòu)[3]，所以相較于其他蛋白而言，SPI穩(wěn)定的球形結(jié)構(gòu)阻礙了SPI分子間的相互作用，導(dǎo)致天然狀態(tài)下其聚集性較差，為滿足食品加工中各類食品的需求，需要改善SPI的聚集特性，酶法改性得益于其溫和安全的反應(yīng)條件與安全高效的操作過程，已成為蛋白質(zhì)食品資源的重要改性方式[4-6]。Zang Xiaodan等[7]報道了木瓜蛋白酶與植酸酶混合處理可提升SPI的乳化性能，Kuipers等[8]發(fā)現(xiàn)酶處理可拓寬SPI的冷凝膠條件。酶解處理不僅提高了SPI的功能性質(zhì)，并且增強了食品的營養(yǎng)特性，因此，SPI的酶法改性受到了食品工業(yè)的廣泛關(guān)注。適當(dāng)條件下的酶處理可引起SPI分子構(gòu)象的改變，從而引起蛋白分子間作用力的一系列變化，導(dǎo)致SPI聚集特性改變。藍色刺孢霉是一種從紅曲米中分離得到的一種具有產(chǎn)天冬氨酸蛋白酶（aspartic protease，APs）能力的霉菌[9]，APs可對SPI進行水解[10]，改善其功能特性。本研究通過研究酶解后SPI組分、結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscopy，LSCM）與原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）表征SPI的酶誘導(dǎo)聚集過程與聚集體的性質(zhì)，揭示酶解后組分變化與結(jié)構(gòu)特性的變化與SPI聚集特性之間的相關(guān)性，為SPI聚集特性在食品中的運用提供理論依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂大豆粉由山東省禹王有限公司提供，Quambalaria cyanescens APs為實驗室自制（317.46 U/mL），其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3E型pH計 上海佑科儀器儀表有限公司；UV759紫外-可見光分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；電泳儀 美國Bio-Rad公司；F-4500型熒光分光光度計 日立高新技術(shù)公司；J-815型圓二色光譜儀日本Jasco分析儀器公司；Leica SP8型LSCM 德國萊卡生物系統(tǒng)；Multimode8 型AFM 德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

SPI是由山東禹王有限公司提供的脫脂大豆粉為原料制得。制備步驟如下：將脫脂大豆粉懸浮于10 倍體積的蒸餾水中，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，室溫攪拌2 h后，置于離心機中以13 000×g離心20 min，收集上清液；上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，隨后13 000×g離心15 min，收集沉淀，即為SPI。樣品凍干后，在4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SPI水解度的測定

采用pH-stat法，根據(jù)Adler-Nissen[11]的方法測定SPI在不同水解時間下的水解度，稱取一定量的SPI，用pH 7.0、10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液配制為最終質(zhì)量濃度5 mg/mL的SPI分散液，均質(zhì)后的體系中加入Quambalaria cyanescens APs（質(zhì)量分數(shù)1%），當(dāng)所需的酶解時間達到后，加入2 mL的1 mg/mL Pepstatin A溶液終止酶解反應(yīng)，滴定起始pH 8.0，水解過程中不斷加入0.5 mol/L的NaOH溶液以維持體系pH值穩(wěn)定在8.0，水解度表示為在水解過程中破壞肽鍵與天然蛋白質(zhì)中肽鍵總量之間的比值，由下式計算：

式中：B為反應(yīng)過程中消耗堿量/mL；NB為堿濃度/（mol/mL）；α為α-氨基酸在體系中的平均解離度，本實驗條件下取0.93[11]；M為被酶解蛋白的總質(zhì)量/g；hTOT為每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵物質(zhì)的量，本實驗條件下為7.8 mmol/g[11]。

1.3.3 濁度的測定

采用UV759紫外-可見光分光光度計測定SPI在不同水解時間660 nm波長處光密度，以此表示濁度變化，表征SPI水解過程中聚集程度。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

采用Leammli[12]建立的不連續(xù)的電泳系統(tǒng)，將12%分離膠溶液灌注到膠室中，加膠高度為整個膠室的3/4。待分離膠完全聚合，除去分離膠膠面的水封層后，將配好的3%濃縮膠溶液灌注到分離膠的上方，至距凹玻璃板上方0.5 cm處，快速插入進樣梳，待濃縮膠完全聚合后，將主體放入電泳槽內(nèi)。并倒入適量的pH 8.3的電極緩沖液，準確稱取0.001 g冷凍干燥后的不同酶解時間SPI置于EP管中，加入1 mL包含0.05 mol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液、1% SDS、10%甘油、0.02%溴酚藍和1% β-巰基乙醇的還原性樣品溶解液，在沸水浴中加熱3 min，冷卻至室溫后加樣。加入10 μL樣品溶液和Marker，加至凝膠凹型樣品槽的底部。初始電流為15 mA，待樣品進入分離膠后，將電流調(diào)至30 mA，當(dāng)溴酚藍染料距凝膠底部1 cm時停止電泳，將膠片取出固定、染色、脫色。

1.3.5 內(nèi)源熒光光譜分析

將不同酶解時間處理后的SPI用10 mmol/mL pH 7.0磷酸鹽稀釋至最終質(zhì)量濃度為0.05 g/mL，為減少SPI內(nèi)部酪氨酸對熒光光譜的貢獻，設(shè)置激發(fā)波長為280 nm，在300～500 nm波長范圍內(nèi)掃描檢測SPI內(nèi)源性熒光強度的變化，掃描速率240 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。

1.3.6 圓二色光譜分析

將不同酶解時間處理后的SPI用超純水稀釋至0.05 g/mL，以超純水為背景去除背景噪音，在溫度25 ℃、掃描速度100 nm/min、帶寬1.0 nm、反應(yīng)時間0.50 s條件下測定SPI在遠紫外區(qū)（185～245 nm）的圓二色性。利用Applied Photophysics軟件表征SPI的二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量的變化。

1.3.7 LSCM觀察

將酶解后的SPI酶解液稀釋至1 mg/mL，取1 mL稀釋后的SPI加入10 μL 0.2 g/100 mL Rhodamine B染料，取20 μL染色后的SPI溶液滴加于凹槽載玻片中，蓋上蓋玻片，并用指甲油密封以防止加熱過程中溶液揮發(fā)，在40 ℃保溫2 h后，置于4 ℃保藏12 h。用Leica SP8型LSCM觀察SPI的聚集狀態(tài)。激發(fā)光568 nm，物鏡參數(shù)40×/NA 0.85。

1.3.8 AFM觀察

采用輕敲模式對不同酶解時間處理后的SPI微觀聚集形態(tài)進行觀察，探針微懸臂長度為180 μm，針尖曲率半徑為10 nm，針尖為商用氮化硅針尖，力常數(shù)為2.8 N/m。所有圖像只經(jīng)過自動平滑處理，以消除慢掃描方向上的低頻噪音。每個樣品隨機選取6 個不同的區(qū)域，并用圖像分析軟件對SPI聚集體的微觀形態(tài)進行表征。

1.4 統(tǒng)計及分析

每組數(shù)據(jù)至少重復(fù)3 次，利用Origin 8.5軟件處理數(shù)據(jù)作圖，利用SPSS V17.0軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA差異顯著性分析及t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶解時間SPI的水解度與濁度

圖1 SPI的水解度與濁度變化Fig. 1 Change in DH value and turbidity of SPI

由圖1可知，SPI的水解度與濁度隨著酶解時間的延長而增加，通過SPI水解度的變化曲線可知，SPI的水解速度隨酶解時間的延長而減緩，并且在90 min左右到達酶解過程終點；由SPI的濁度變化曲線可知，SPI的聚集程度隨酶解時間延長而增大，但相較于SPI的水解程度，SPI的聚集行為存在一定的滯后，黃蘇[13]研究木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的SPI酶促聚集行為，也發(fā)現(xiàn)相似的SPI聚集行為較于水解進程的滯后，可能由于水解初期所引起的SPI聚集驅(qū)動力的變化不足以克服SPI分子間保持的斥力，從而導(dǎo)致酶解SPI聚集行為的滯后現(xiàn)象。

2.2 不同酶解時間SPI的SDS-PAGE分析

圖2 不同時間酶處理后SPI的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of SPI with different AP treatment times

SPI主要由7S和11S球蛋白組成，7S球蛋白主要由α（58～83 kDa）、α’（58～77 kDa）、β（42～53 kDa）3 個亞基結(jié)合而成[14-16]，11S球蛋白由6 個亞基組成，每個亞基包含1 條酸性肽鏈和1 條堿性肽鏈，這些亞基通過二硫鍵連接起來，酸性肽鏈和堿性肽鏈的分子質(zhì)量為31～45 kDa和18～20 kDa[17-18]。由圖2可知，天然SPI在40～55 kDa范圍內(nèi)具有清晰蛋白條帶，此部分為SPI 7S組分中的β亞基（42～53 kDa），隨著酶處理時間延長，β亞基條帶逐漸消失，同時在37 kDa左右出現(xiàn)了新蛋白條帶的多肽，表明7S球蛋白中的β亞基被解離，并形成了分子質(zhì)量大約為37 kDa的組分；相似的，在32 kDa的11S中酸性多肽鏈的條帶逐漸變淡直至消失，說明酶處理使得SPI中7S、11S中的亞基解離以及重排；相比之下，7S組分亞基的解離與11S相比較為明顯，可歸結(jié)于11S亞基的連接主要是通過二硫鍵結(jié)合，二硫鍵的鍵合方式在一定程度上阻礙了APs對11S組分的水解[13]。

2.3 內(nèi)源熒光光譜表征SPI的結(jié)構(gòu)變化

圖3 SPI的內(nèi)源熒光光譜變化Fig. 3 Change in intrinsic fl uorescence emission spectrum of SPI with different AP treatment times

SPI的內(nèi)源熒光主要由分子內(nèi)的色氨酸殘基貢獻，色氨酸殘基所處環(huán)境的變化將會引起其熒光光譜的變化，因此，基于色氨酸殘基的內(nèi)源熒光光譜常被用于蛋白相對構(gòu)象變化的表征[19]。由圖2可知，APs酶處理組的SPI的熒光強度均高于對照（0 min），這是由于在天然狀態(tài)下的SPI具有穩(wěn)固的球形結(jié)構(gòu)，由于疏水水合作用，色氨酸等疏水性基團被包裹在蛋白結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，隨著水解程度的增加，SPI相對構(gòu)象發(fā)生變化，將色氨酸殘基等疏水性基團暴露于外部的親水環(huán)境中，從而導(dǎo)致了SPI熒光強度的變化。不僅如此，在酶處理過程中，SPI熒光強度隨酶解時間（30～60 min）上升而下降并且伴隨著峰位的輕微藍移（344～340 nm），這種漸進的熒光淬滅現(xiàn)象可以歸結(jié)于蛋白結(jié)構(gòu)的部分恢復(fù)（或）及其聚集行為使暴露的色氨酸殘基恢復(fù)到疏水環(huán)境中[20]；此外，臨近色氨酸蛋白分子間二硫鍵的形成也可以通過電子轉(zhuǎn)移過程導(dǎo)致類似熒光淬滅現(xiàn)象[21]。因此，APs酶解處理可使SPI相對構(gòu)象改變及其內(nèi)部疏水基團暴露，蛋白疏水基團的暴露可導(dǎo)致更強烈、更廣泛的疏水相互作用，從而誘導(dǎo)了SPI的聚集[22]。

2.4 圓二色光譜表征SPI二級結(jié)構(gòu)變化

圖4 SPI遠紫外圓二色光譜的變化Fig. 4 Changes in far-UV CD spectrum of SPI with different AP treatment times

圖4 顯示，對照組（0 min）SPI的圓二色光譜在209 nm處顯示出一個清晰的負峰，在190 nm處顯示出一個正峰，這表明SPI具有高度有序的典型α＋β結(jié)構(gòu)[23]，并且β-折疊結(jié)構(gòu)含量占優(yōu)勢[24]，APs酶解處理導(dǎo)致SPI二級結(jié)構(gòu)顯著性變化，隨著酶解時間的延長，SPI的負峰向長波長方向逐漸偏移并且伴隨著明顯的熒光強度升高；SPI的正峰未發(fā)現(xiàn)明顯偏移但其強度也有輕微下降。通過Applied Photophysics計算機軟件分析光譜得到SPI酶處理過程中二級結(jié)構(gòu)含量的變化，酶處理0、30、60、90、120 min的SPI的α-螺旋含量分別為：（7.0±0.12）%、（10.3±0.05）%、（12.5±0.13）%、（15.7±0.07）%、（16.4±0.09）%；β-折疊含量分別為：（51.9±0.08）%、（42.8±0.09）%、（4 0.3±0.0 7）%、（3 9.2±0.0 4）%、（38.4±0.16）%；無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量變化不顯著（P＞0.05）。實驗結(jié)果表明APs酶處理導(dǎo)致了SPI二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量的上升及β-折疊含量的下降，類似的結(jié)構(gòu)變化現(xiàn)象也出現(xiàn)在SO2誘導(dǎo)的葡萄酒中類奇異果甜蛋白的聚集行為中[25]，根據(jù)Kim等[26]的研究，具有相同氨基酸序列的α-螺旋結(jié)構(gòu)相較于β-折疊結(jié)構(gòu)具有更高的聚集傾向。因此，蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量的增加有助于提升蛋白的聚集特性，從而引發(fā)蛋白的聚集行為。

2.5 LSCM分析

圖5 SPI酶誘導(dǎo)聚集行為的LSCM圖像Fig. 5 CLSM images of SPI aggregation behavior

如圖5所示，天然狀態(tài)下的SPI呈圓球狀，通過靜電相互作用與疏水作用穩(wěn)定分散在溶液中，與Rhodamine B結(jié)合后熒光較弱。Rhodamine及其衍生物是屬于咕噸類的堿性染料，第3芳環(huán)（簡稱底環(huán)）可通過活性基與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子及組成單體分子中的—NH2、—OH、—SH等形成共價鍵[27-29]，使其熒光特性發(fā)生變化；在天然SPI結(jié)構(gòu)中，—NH2與—SH基團大部分被包埋在SPI結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，從而導(dǎo)致圖A中熒光強度較低；隨著酶處理時間的延長，SPI結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致更多基團與Rhodamine B染料結(jié)合，使其熒光強度上升（圖5B～E）。酶處理誘導(dǎo)了SPI的聚集行為，從圖5可以直觀地觀察到，隨著酶處理時間的延長，SPI形成了大小不均并且不連續(xù)的的聚集體，說明APs誘導(dǎo)的SPI聚集行為未能使SPI分子間產(chǎn)生足夠的共價交聯(lián)形成連續(xù)的凝膠體系，其聚集的主要驅(qū)動力還是由于SPI結(jié)構(gòu)變化所導(dǎo)致的疏水相互作用以及靜電作用力等非共價作用力[29-31]。

2.6 AFM分析

圖6 SPI在不同酶處理時間下聚集體的AFM圖像Fig. 6 AFM images of SPI aggregates with different enzyme treatment times

圖6 顯示了酶處理過程中由AFM觀察到的SPI微觀表面形態(tài)，未經(jīng)酶處理的SPI主要以單體形式存在，簡單地吸附在云母片表面。當(dāng)酶處理時間在0～60 min時，SPI分子逐漸開始形成較小、較為分散的聚集體（圖6B、C），此結(jié)果與LSCM觀察的結(jié)果相一致，當(dāng)酶解時間進一步從60 min延長至120 min時，SPI間的聚集程度明顯增加，逐漸產(chǎn)生橫向融合，形成如圖6D、E的團狀不連續(xù)的聚集體，并在云母片表面形成了不規(guī)則的堆積結(jié)構(gòu)。利用Nanoscope analysis軟件對SPI酶誘導(dǎo)聚集過程中的三維結(jié)構(gòu)進行分析，不同酶處理時間下的SPI的平均表面粗糙度（Ra）分別為1.01、6.84、11.6、40.9、162 nm，Ra作為統(tǒng)計學(xué)的基本參數(shù)，能夠反映樣品表面粗糙程度的大小，即聚集程度的大小，Ra的增加說明SPI隨著酶處理時間的延長，其宏觀聚集程度增大，從而在云母片表面形成了不連續(xù)、不規(guī)則的SPI聚集體。

3 結(jié) 論

研究表明，APs處理可誘導(dǎo)SPI的聚集行為。SPI的水解度與濁度在酶處理過程中隨處理時間的延長而增大，表明SPI的解離程度與聚集程度隨酶處理時間的延長而增大；酶處理導(dǎo)致了SPI亞基的解離，將大分子質(zhì)量SPI水解為具有較小分子質(zhì)量的組分，其中7S組分較11S的解離程度較大。酶處理還導(dǎo)致SPI天然構(gòu)象的改變，使埋藏在分子內(nèi)部的疏水性基團及疏水性氨基酸暴露于更加親水的外部環(huán)境中，造成了SPI分子間更強、更廣泛的疏水相互作用；酶處理后的SPI結(jié)構(gòu)中具有更高聚集傾向的α-螺旋含量增加，同時使SPI中對其二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要作用的β-折疊含量下降，增加了SPI分子的聚集傾向。APs誘導(dǎo)的SPI聚集行為并沒有形成高度有序的、連續(xù)的三維凝膠結(jié)構(gòu)，聚集體很大程度依賴于非共價作用力形成不規(guī)則的堆積結(jié)構(gòu)，其微觀結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為不連續(xù)、不規(guī)則的團狀聚集體。