張啟龍，孫丹，韋海濤，宋彥軍，周德剛，馮小宇，王林*

(1.北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629；2.北京市獸藥監(jiān)察所，北京 102629)

肝炎-心包積液綜合征(Hepatitis and hydropericardium syndrome，HHS)是由禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)新基因型引起的以禽心包積液、肝臟黃染、腫大和出血為特征的傳染病[1]。HHS首次于1987年在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)發(fā)生，又名安卡拉病，隨后在亞洲、歐洲和南美洲等地區(qū)流行[2-4]。2013年以來(lái)該病在我國(guó)河南、山東、江蘇、河北、陜西等地大面積流行，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[5-7]。FAdV-4屬于禽腺病毒Ⅰ群，呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，病毒粒子大小在70～90nm[8]。FAdV-4病毒粒子有252個(gè)衣殼粒，包含240個(gè)六鄰體(Hexon)和12個(gè)五鄰體(頂點(diǎn)衣殼粒)[9]。研究表明，Hexon蛋白是特異性抗原決定簇，可以引發(fā)極強(qiáng)的中和反應(yīng)，當(dāng)六鄰體發(fā)生變異將導(dǎo)致中和免疫的缺失，可作為診斷型和群的首選蛋白[10-11]。FAdV-4的Hexon抗原表位主要集中在前段、中段，推測(cè)其具有型和群特異性表位[12-13]。為此，本試驗(yàn)利用前期重組表達(dá)的FAdV-4 Hexon蛋白作為包被抗原，通過(guò)一系列條件的優(yōu)化，建立I群FAdV-4 IgG抗體間接ELISA檢測(cè)方法，為臨床檢測(cè)和有效防控提供技術(shù)支撐。

1 材 料

1.1 抗原與對(duì)照抗體 純化重組Hexon蛋白，由北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心制備；I群FAdV-4 IgG陰、陽(yáng)性對(duì)照抗體，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 試劑 0.05 mol/L PBS、PBST均購(gòu)自Thermo Scientific公司； HRP-兔抗雞二抗購(gòu)自Sigma公司；底物溶液購(gòu)自湖州生物技術(shù)有限公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 臨床樣品 臨床樣品由北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心采集。

2 方 法

2.1 FAdV-4抗體間接ELISA操作基本方法 將純化的重組Hexon蛋白用0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液稀釋后包被96孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，37 ℃孵育5 h后2～8 ℃作用14～18 h。棄去孔中的包被液，每孔加入250 μL PBST洗滌酶標(biāo)板5次，每次3 min。按每孔200 μL加入封閉液，37 ℃封閉2 h后棄去，每孔加入250 μL PBST洗滌酶標(biāo)板1次，每次3 min。加入待檢樣品，100 μL/孔，37 ℃孵育30～120 min。棄去液體，每孔加入250 μL PBST洗滌酶標(biāo)板5次，每次3 min。加入稀釋的HRP-兔抗雞二抗，100 μL/孔，置37 ℃孵育30～120 min。棄去液體，每孔加入250 μL PBST洗滌酶標(biāo)板5次，每次5 min。每孔加入底物顯色液100 μL，37 ℃避光顯色5～15 min，然后每孔加入2 mol/L H2SO4溶液50 μL，終止反應(yīng)。利用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD450nm吸光值。

2.2 抗原最佳包被濃度及最佳樣品稀釋度的確定

用棋盤法對(duì)重組Hexon蛋白包被濃度和FAdV-4 IgG抗體陰、陽(yáng)性對(duì)照稀釋度進(jìn)行優(yōu)化：包被液濃度從8 μg/mL倍比稀釋至0.5 μg/mL，100 μL/孔。FAdV-4 IgG抗體陰、陽(yáng)性對(duì)照分別以PBST做1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600稀釋，做方陣試驗(yàn)。根據(jù)P/N值(陽(yáng)性樣品OD450nm/陰性樣品OD450nm)篩選出抗原最佳包被濃度和樣品最佳稀釋度。

2.3 最佳封閉液的選擇 在不包被Hexon蛋白和包被Hexon蛋白后，分別以1%牛血清白蛋白(BSA)、5%脫脂乳、10%馬血清和1%明膠作為封閉液進(jìn)行封閉。檢測(cè)FAdV-4 IgG抗體陰、陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)P/N值選擇最佳封閉液。

2.3.1 直接封閉 不包被任何蛋白，每孔加入300 μL相應(yīng)封閉液，37 ℃封閉2 h。

2.3.2 包被后封閉 以1 μg/mL的純化重組Hexon蛋白包被ELISA板，分別用不同的封閉液封閉，每孔加300 μL，37 ℃封閉2 h。

2.4 樣品孵育時(shí)間的優(yōu)化 將FAdV-4 IgG抗體陰、陽(yáng)性對(duì)照的孵育時(shí)間設(shè)置30 min、60 min、90 min、120 min四個(gè)梯度，分別進(jìn)行FAdV-4 ELISA試驗(yàn)，根據(jù)P/N值結(jié)果篩選出最佳樣品孵育時(shí)間。

2.5 HRP-兔抗雞二抗最佳工作濃度的測(cè)定 將HRP-兔抗雞二抗分別進(jìn)行1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000倍稀釋，按照以上操作程序進(jìn)行FAdV-4 ELISA試驗(yàn)，根據(jù)P/N值結(jié)果篩選出二抗最佳工作濃度。

2.6 HRP-兔抗雞二抗最佳孵育時(shí)間的優(yōu)化 將二抗以1∶8000稀釋后分別孵育30 min、60 min、90 min、120 min，按照以上操作程序進(jìn)行FAdV-4 ELISA試驗(yàn)，根據(jù)P/N值結(jié)果篩選純化二抗最佳工作時(shí)間。

2.7 底物(TMB)反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 將底物的作用時(shí)間分別設(shè)置為5 min、7 min、10 min、15 min，按照以上操作程序進(jìn)行FAdV-4 ELISA試驗(yàn)，根據(jù)P/N值結(jié)果篩選出底物最佳作用時(shí)間。

2.8 臨床樣品檢測(cè) 采集160只臨床雞只血清進(jìn)行新建間接ELISA方法檢測(cè)，同時(shí)對(duì)雞只采集拭子依據(jù)《Ⅰ群血清4型禽腺病毒核酸PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》(DB 34/T 3121-2018)進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)比兩種方法的一致性。

3 結(jié)果與分析

3.1 抗原最佳包被濃度及最佳樣品稀釋度的確定

不同濃度的抗原和不同稀釋度的FAdV-4 IgG抗體陰、陽(yáng)性對(duì)照按正交試驗(yàn)的方法進(jìn)行組合，每組設(shè)置2個(gè)重復(fù)取平均值。由表1可知，在抗原包被濃度為1 μg/mL，F(xiàn)AdV-4 IgG抗體陰、陽(yáng)性對(duì)照稀釋400倍時(shí)，P/N值最大，非特異性最小，試驗(yàn)的靈敏度最高，所以確定包被抗原的濃度為1 μg/mL，F(xiàn)AdV-4 IgG抗體陰、陽(yáng)性對(duì)照稀釋400倍時(shí)檢測(cè)效果最佳。

表1 包被濃度和樣品稀釋度的確定

3.2 最佳封閉液的選擇 如表2所示，在不包被任何蛋白的情況下，用1%明膠、10%馬血清封閉時(shí)，F(xiàn)AdV-4 IgG抗體陽(yáng)性對(duì)照的OD450nm值較高，都在0.5以上，表明FAdV-4 IgG抗體陽(yáng)性對(duì)照與封閉液之間存在非特異性結(jié)合。而用5%脫脂奶和1% BSA封閉時(shí)，F(xiàn)AdV-4 IgG抗體陽(yáng)性對(duì)照的OD450nm值基本都在0.2以下，表明FAdV-4 IgG抗體陽(yáng)性對(duì)照與這兩種封閉液之間的非特異性結(jié)合程度較小。在包被Hexon蛋白抗原后，用1% BSA和5%脫脂奶進(jìn)行封閉，陰陽(yáng)性區(qū)分明顯，表明1% BSA和5%脫脂奶作為封閉液時(shí)對(duì)抗原抗體特異性結(jié)合干擾較小，選擇P/N值較大的1% BSA作為最佳封閉液。

表2 最佳封閉液的確定

3.3 樣品孵育時(shí)間的優(yōu)化 在以上優(yōu)化的基礎(chǔ)上，按確定的抗原包被條件、樣品稀釋度及最佳封閉液，將抗原和抗體作用的時(shí)間分別設(shè)為30 min、60 min、90 min和120 min，其他條件相同，選擇樣品最佳孵育時(shí)間。結(jié)果見表3，發(fā)現(xiàn)樣品作用時(shí)間為30 min時(shí)P/N值最小，作用60 min、90 min和120 min時(shí)P/N接近，考慮到ELISA反應(yīng)時(shí)間越短越便利，因此選擇60 min為最佳樣品孵育時(shí)間。

3.4 HRP-兔抗雞二抗最佳稀釋度的確定 將酶標(biāo)二抗按1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000倍稀釋加入酶標(biāo)板中，其他條件相同，選擇最佳二抗稀釋度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRP-兔抗雞二抗稀釋度為1∶8000時(shí)，P/N的比值最大，因此HRP-兔抗雞二抗抗體的最佳稀釋度為1∶8000，結(jié)果見表4。

3.5 HRP-兔抗雞二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 在以上優(yōu)化的條件下，試驗(yàn)酶標(biāo)二抗不同孵育時(shí)間的P/N值。結(jié)果如表5所示，當(dāng)酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)，P/N值最大，因此酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min。

3.6 底物(TMB)顯色時(shí)間的確定 結(jié)果如表6顯示，當(dāng)顯色反應(yīng)為10 min時(shí)，P/N的值最大，因此底物(TMB)最佳顯色時(shí)間為10 min。

3.7 陰、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)臨界值的確定 取50份FAdV4抗體為陰性的血清樣品，按照確定的條件進(jìn)行間接ELISA，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，計(jì)算OD450nm的平均值及標(biāo)準(zhǔn)方差(s)，為消除每次間接ELISA檢測(cè)時(shí)，試驗(yàn)環(huán)境及操作的影響，每次檢測(cè)時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清作為對(duì)照，陽(yáng)性血清OD450nm約等于1.0，否則結(jié)果無(wú)效；經(jīng)計(jì)算，50份陰性血清OD450nm的平均值為0.174，標(biāo)準(zhǔn)差s為0.0764，因此間接ELISA陰陽(yáng)性的臨界值(平均值+3s)為0.403(表7)，為計(jì)算方便定為0.4。因此，當(dāng)樣品OD450nm≥0.4時(shí)，判定I群FAdV抗體水平為陽(yáng)性，當(dāng)樣品OD450nm<0.4時(shí)，判定I群FAdV抗體陰性。

表3 樣品反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

表4 HRP-兔抗雞二抗最佳稀釋度的確定Tab 4 Determination of the optimal dilution ofHRP- rabbit anti - chicken secondary antibody

表5 HRP-兔抗雞二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定Tab 5 Determination of HRP- rabbit anti-chickensecond antibody optimal reaction time

表6 底物最佳顯色時(shí)間的確定

表7 陰陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)臨界值的確定Tab 7 Determination of negative and positive standard critical value

3.8 臨床樣品I群FAdV-4抗體的檢測(cè) 對(duì)160份臨床雞血清樣品，按照確定的條件進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)以及拭子PCR檢測(cè)，結(jié)果見表8。經(jīng)分析統(tǒng)計(jì)兩者kappa值為0.924(P<0.001)，結(jié)果表明兩種檢測(cè)方法一致性較好。160份血清樣本用建立的間接ELISA進(jìn)行檢測(cè)有46份樣本為陽(yáng)性，血清陽(yáng)性率為28.75%，說(shuō)明北京市部分雞群中存在I群FAdV-4感染。

表8 兩種方法檢測(cè)臨床樣品的一致性結(jié)果

4 討論與結(jié)論

HHS是主要由FAdV-4引起的一種具有高度傳染性和高死亡率的新型家禽疾病。2000年前后，國(guó)內(nèi)報(bào)道的FAdV病毒的血清型主要為1型、2型、8型、9型、10型和12型。2012年FAdV-4引起的HHS在我國(guó)許多地區(qū)零星散發(fā)，2013年呈現(xiàn)出暴發(fā)式增長(zhǎng)[14-16]，2015-2018年國(guó)內(nèi)報(bào)道的FAdV的血清型仍然主要是4型[17-20]。

FAdV-4病毒衣殼蛋白主要由六鄰體、纖突蛋白、五鄰體和五鄰體周圍蛋白等構(gòu)成。六鄰體是腺病毒最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，含有大量的型特異性抗原，同時(shí)也是病毒對(duì)免疫壓力最弱的地方[21]。本研究利用前期分離到I群FAdV-4 新基因型克隆表達(dá)的Hexon蛋白作為包被抗原，建立了FAdV-4 ELISA檢測(cè)方法，并對(duì)該檢測(cè)方法的各個(gè)步驟進(jìn)行了條件優(yōu)化，確定該檢測(cè)方法的最適條件：樣品稀釋400倍檢測(cè)；抗原最佳包被濃度為1 μg/mL；最適合的封閉液為含1% BSA的磷酸鹽緩沖液；最合適的樣品孵育時(shí)間為1 h；最適合的二抗稀釋濃度和反應(yīng)時(shí)間為1∶8000稀釋反應(yīng)1 h；最適合的底物顯示時(shí)間為10 min。取50份FAdV4抗體為陰性的血清樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè)，通過(guò)平均值+3s的方法計(jì)算確定本ELISA方法的臨界值為0.4。

目前國(guó)內(nèi)I群FAdV-4尚沒有相關(guān)血清學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)專業(yè)知識(shí)，血清學(xué)檢測(cè)與病原學(xué)檢測(cè)存在較大相關(guān)性，故本研究在臨床樣品檢測(cè)階段與現(xiàn)有PCR方法進(jìn)行了一致性比較，結(jié)果較好。在當(dāng)前我國(guó)尚未使用疫苗對(duì)HHS進(jìn)行普遍防疫的情況下，加強(qiáng)HHS血清流行病學(xué)調(diào)查，可為HHS早期有效的防控措施提供指導(dǎo)。ELISA具有快速、可操作性強(qiáng)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，常被作為血清流行病學(xué)調(diào)查的主要方法。部分臨床樣品檢測(cè)表明北京市雞群存在FAdV-4感染，應(yīng)當(dāng)引起重視，及時(shí)采取有效防控措施。