馮二凱，易立，羅國(guó)良，王振軍，郭利，陳立志，程世鵬，程悅寧*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112； 2.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司，長(zhǎng)春 130122)

犬瘟熱(canine distemper，CD)是犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)感染引起的、可導(dǎo)致多種食肉動(dòng)物患病的一種急性、接觸性傳染病[1]，可感染所有的犬科、鼬科以及水生哺乳動(dòng)物，且感染宿主范圍正在不斷擴(kuò)大[2-3]。不同動(dòng)物對(duì)CDV的易感性和致死率各不相同，從30%～80%不等，對(duì)我國(guó)的養(yǎng)犬業(yè)，毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生珍稀動(dòng)物保護(hù)造成了很大危害。

犬瘟熱臨床防治沒(méi)有治療藥物，只能通過(guò)疫苗接種免疫預(yù)防。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所先后研究了我國(guó)第一代和第二代水貂犬瘟熱活疫苗，疫苗的成功研制為有效控制我國(guó)毛皮動(dòng)物犬瘟熱疫情的發(fā)生和流行奠定了基礎(chǔ)。為了適應(yīng)毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)對(duì)高品質(zhì)生物制品的需求，提升企業(yè)產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所又開展了水貂犬瘟Vero細(xì)胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))的懸浮培養(yǎng)工藝的開發(fā)工作。

本研究在前期建立犬瘟熱Vero細(xì)胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上[4-6]，利用建立的疫苗懸浮制備工藝生產(chǎn)3批疫苗半成品，實(shí)驗(yàn)室根據(jù)《新獸藥研制管理辦法》、《獸用生物制品注冊(cè)分類及注冊(cè)資料要求》的有關(guān)規(guī)定，制備了三批水貂犬瘟熱Vero細(xì)胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))，在疫苗檢驗(yàn)合格的基礎(chǔ)上對(duì)疫苗的安全性進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種毒與細(xì)胞 非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所保存；犬瘟熱CDV3-CL毒株第15代(基礎(chǔ)毒種)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所鑒定和保存。

1.1.2 試驗(yàn)用疫苗 安全性試驗(yàn)用3批犬瘟熱Vero活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))凍干品(批號(hào)：201701、201702、201703)，由吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，規(guī)格為15頭份/瓶，2017年1月份制備，疫苗在-20 ℃以下條件下保存。

1.1.3 微載體混懸液(5 g/L) 取已硅化藍(lán)蓋瓶，稱5 g微載體，按照100 mL/g微載體的比例加入無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS，于4 ℃浸泡過(guò)夜；次日棄PBS和漂浮微載體，按200 mL/g微載體的比例加入無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS，120 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至室溫備用。

1.1.4 細(xì)胞維持液 含有2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，用于接毒后病毒增殖。

1.1.5 試驗(yàn)動(dòng)物 品系：美國(guó)短毛黑；2～4月齡和8～10月齡水貂以及妊娠30～35 d水貂(中和抗體SN≤1∶4)，由吉林中特農(nóng)業(yè)科技有限公司異獸路分公司提供。安全試驗(yàn)動(dòng)物選擇健康，未接種任何疫苗的水貂。

1.2 方法

1.2.1 疫苗檢驗(yàn) 參照農(nóng)業(yè)部第2215號(hào)公告[7]要求，對(duì)3批疫苗進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，質(zhì)量檢驗(yàn)由吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司質(zhì)量管理部完成。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物 本試驗(yàn)對(duì)2～4月齡水貂幼崽、8～10月齡育成水貂和妊娠30～35 d水貂進(jìn)行安全性測(cè)試。試驗(yàn)動(dòng)物管理按正常條件進(jìn)行飼養(yǎng)管理；水貂均為單籠飼養(yǎng)，分組試驗(yàn)。

1.2.3 疫苗安全性評(píng)價(jià)指標(biāo) 包括全身性和局部安全檢查。全身性檢查包括體溫監(jiān)測(cè)、精神狀態(tài)、食欲變化、幼獸生長(zhǎng)性能、妊娠水貂是否流產(chǎn)等；局部檢查包括注射部位有無(wú)炎癥或破潰、局部吸收情況等。

1.2.4 單劑量皮下接種安全性試驗(yàn) 3批疫苗分別接種2～4月齡和8～10月齡水貂，10只/組，后肢內(nèi)側(cè)皮下接種，1頭份/只，接種后連續(xù)觀察14 d，觀察全身和接種局部變化；接種后10 d內(nèi)每日記錄體溫變化。第15 d剖殺水貂，檢查接種部位有無(wú)病理變化。

1.2.5 單劑量重復(fù)皮下接種安全性試驗(yàn) 3批疫苗分別接種2～4月齡水貂進(jìn)行單劑量重復(fù)接種試驗(yàn)，10只/組，后肢內(nèi)側(cè)皮下接種，1頭份/只，兩次接種時(shí)間間隔14 d，二次接種后繼續(xù)觀察全身和接種局部變化；重復(fù)接種后10 d內(nèi)，每日記錄體溫變化。

1.2.6 超劑量皮下接種安全性試驗(yàn) 3批疫苗分別接種2～4月齡水貂進(jìn)行試驗(yàn)；10只/組，后肢內(nèi)側(cè)皮下接種，10頭份/只，分四點(diǎn)注射，接種后連續(xù)觀察14 d，觀察全身和接種局部變化，接種后10 d內(nèi)，每日記錄體溫變化。第15天剖殺水貂，檢查接種部位有無(wú)病理變化。

1.2.7 微載體安全性試驗(yàn) 將制備的微載體混懸液(5 g/L)接種水貂幼崽和育成水貂，考察微載體對(duì)水貂的安全性，5只/組，后肢內(nèi)側(cè)皮下接種，1.0mL/只，分兩點(diǎn)注射，接種后連續(xù)觀察14d，觀察全身和接種局部變化，并在接種后10 d內(nèi)，每日記錄體溫變化。第15天剖殺水貂，檢查接種部位有無(wú)病理變化。

1.2.8 妊娠水貂安全性試驗(yàn) 3批疫苗分別接種妊娠30～35 d水貂進(jìn)行安全性試驗(yàn)。每組試驗(yàn)接種水貂10只，后肢內(nèi)側(cè)皮下接種，1頭份(毫升)/只，接種后觀察至產(chǎn)仔后1個(gè)月，記錄妊娠水貂是否出現(xiàn)流產(chǎn)。

1.2.9 對(duì)照組 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置對(duì)照組，水貂注射細(xì)胞維持液，5只/組，注射劑量、方式與上述試驗(yàn)同步進(jìn)行。

1.2.10 組織病理切片分析 在每組試驗(yàn)的末期(第15天)，剖殺2只水貂，觀察接種部位有無(wú)炎癥或破潰；取接種部位肌肉，甲醛固定后，經(jīng)HE染色后，觀察各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物接種部位組織病理變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 犬瘟熱Vero細(xì)胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果 三批犬瘟熱Vero細(xì)胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))無(wú)菌檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)均為陰性，表明3批疫苗質(zhì)量均符合標(biāo)準(zhǔn)，可以用于臨床安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)；疫苗凍干后每頭份病毒含量為103.80～104.00TCID50/0.1 mL(表1)。

表1 三批犬瘟熱Vero細(xì)胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))檢驗(yàn)結(jié)果Tab 1 The inspection result of three batch of CDV vaccine(CDV3-CL strain，suspension)

“-”表示檢測(cè)結(jié)果陰性

2.2 一次單劑量皮下接種安全性試驗(yàn)結(jié)果 3批疫苗接種水貂幼崽(2～4月齡)及育成水貂(8～10月齡)，通過(guò)14 d觀察，接種10 d內(nèi)各組水貂平均體溫變化正常(未連續(xù)2 d超過(guò)40.5 ℃)(圖1和圖2)；水貂食欲、糞便及精神狀態(tài)均正常，接種局部無(wú)腫脹和炎癥，未出現(xiàn)局部和全身炎癥反應(yīng)(表2和表3)。

圖1 疫苗對(duì)水貂一次單劑量接種后體溫變化圖(2～4月齡)Fig 1 The fluctuate curve of body temperature ofmink received one dose vaccine(2～4 month)

圖2 疫苗對(duì)水貂一次單劑量接種后體溫變化圖(8～10月齡)Fig 2 The fluctuate curve of body temperature ofmink received one dose vaccine(8～10 month)

表2 疫苗對(duì)水貂一次單劑量接種安全性試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(2～4月齡)

表3 疫苗對(duì)水貂一次單劑量接種安全性試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(8～10月齡)Tab 3 The security test record of one dose vaccine inoculation (8～10 month)

“-”代表水貂被打皮，未統(tǒng)計(jì)

2.3 單劑量重復(fù)皮下接種安全性試驗(yàn)結(jié)果 3批疫苗接種2～4月齡水貂幼崽，間隔14 d重復(fù)接種1次，通過(guò)14 d觀察，接種水貂10 d內(nèi)平均體溫未超過(guò)40.5 ℃(圖3)；水貂食欲、糞便和精神狀態(tài)均正常，接種局部無(wú)腫脹和炎癥，未出現(xiàn)局部和全身反應(yīng)(表4)。

2.4 超劑量皮下接種安全性試驗(yàn)結(jié)果 3批疫苗超劑量接種2～4月齡水貂幼崽，通過(guò)14 d觀察，實(shí)驗(yàn)組水貂10 d內(nèi)平均體溫未超過(guò)40.5℃；3批疫苗接種后2～3 d內(nèi)，水貂會(huì)出現(xiàn)體溫短暫升高到40.5 ℃以上情況(圖4)；水貂糞便和精神正常，疫苗接種局部無(wú)腫脹和炎癥，未出現(xiàn)局部和全身反應(yīng)(表5)。

圖3 疫苗單劑量重復(fù)接種水貂體溫變化圖Fig 3 The fluctuate curve of body temperature of minkreceived single dose repeat inoculation of vaccine

圖4 疫苗超劑量接種水貂后體溫測(cè)定結(jié)果Fig 4 The fluctuate curve of body temperature ofmink received overdose of vaccine

表4 疫苗單劑量重復(fù)接種安全性試驗(yàn)結(jié)果

表5 疫苗超劑量接種水貂安全性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 單劑量妊娠水貂安全性試驗(yàn)結(jié)果 3批試驗(yàn)疫苗皮下接種30～35日齡妊娠水貂，通過(guò)臨床觀察，接種水貂食欲、糞便和精神狀態(tài)均正常，觀察至產(chǎn)仔，未出現(xiàn)流產(chǎn)，產(chǎn)后胎兒發(fā)育未發(fā)現(xiàn)異常(表6)，說(shuō)明疫苗對(duì)妊娠水貂具有較好的安全性。

2.6 微載體安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果 微載體接種水貂幼崽(2～4月齡)后，接種10 d內(nèi)各組水貂平均體溫變化正常，與對(duì)照組沒(méi)有顯著區(qū)別(圖5)；水貂食欲、糞便及精神狀態(tài)均正常，接種局部無(wú)腫脹和炎癥，未出現(xiàn)局部和全身炎癥反應(yīng)(表7)。

表6 疫苗對(duì)妊娠水貂安全性試驗(yàn)結(jié)果Tab 6 The security test record of pregnancy mink received one dose of vaccine

圖5 微載體接種水貂后體溫測(cè)定結(jié)果Fig 5 The fluctuate curve of body temperature of mink received of microcarrier

組別水貂數(shù)/只水貂年齡接種途徑體溫變化精神食欲接種局部變化生長(zhǎng)性能發(fā)病和死亡/只微載體52～4月齡皮下正常正常無(wú)正常0對(duì)照52～4月齡皮下正常正常無(wú)正常0

2.7 疫苗接種部位組織病理切片觀察 疫苗接種后，無(wú)論是對(duì)照組還是實(shí)驗(yàn)組，接種部位皮下均無(wú)異常變化，僅見顏色與周圍皮膚略有不同，未見炎癥反應(yīng)。病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，接種部位的肌肉組織排列規(guī)整、肌纖維整齊、橫紋肌明顯，未見變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖6)。

圖6 接種部位組織病理切片觀察Fig 6 The histopathology change of the inoculation site of mink

3 討論與結(jié)論

無(wú)論是人用疫苗，還是獸用疫苗，安全和有效是其兩大基本特性。因此，任何一個(gè)新疫苗在研發(fā)階段或者推向市場(chǎng)之前，必須要開展疫苗的安全性評(píng)價(jià)。例如在我國(guó)發(fā)生小反芻獸疫(Peste destits ruminants virus，PRRV)疫情后，為了確保疫區(qū)外動(dòng)物安全，我國(guó)批準(zhǔn)利用PRR Nigerja 75/1疫苗株制造疫苗，并接種羊和豚鼠、小鼠進(jìn)行了免疫接種，評(píng)價(jià)疫苗安全性[8-9]。崔艷麗等[10]在研制了雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感(H9亞型)四聯(lián)滅活疫苗(LaSota株+HS25株+HZ株)后，也在本動(dòng)物上開展了安全性評(píng)價(jià)。本研究為了盡快將利用懸浮培養(yǎng)工藝研制的水貂犬瘟熱Vero細(xì)胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))推向市場(chǎng)，在本動(dòng)物上(水貂)開展了疫苗的安全性評(píng)價(jià)。

根據(jù)農(nóng)業(yè)部442號(hào)[11]公告中獸藥變更注冊(cè)事項(xiàng)及申報(bào)資料要求，改變獸藥生產(chǎn)工藝，其生產(chǎn)工藝的改變不應(yīng)導(dǎo)致藥用物質(zhì)基礎(chǔ)的改變。因此需要對(duì)新工藝研發(fā)的疫苗臨床試驗(yàn)。為了全面評(píng)價(jià)犬瘟熱Vero細(xì)胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))的安全性，參照農(nóng)業(yè)部683號(hào)[12]公告中《獸用生物制品實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，本研究選擇不同年齡的水貂(包括幼崽(2～4月齡)、育成水貂(8～10月齡)、妊娠水貂(30～35 d))進(jìn)行安全性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行，每組10只水貂，采用單劑量(1頭份)皮下接種、單劑量重復(fù)皮下接種(1頭份)、超劑量(10頭份)皮下接種動(dòng)物進(jìn)行安全性試驗(yàn)。結(jié)果表明，接種水貂全身和局部未見異常臨床反應(yīng)，對(duì)幼貂發(fā)育無(wú)不良影響，體溫波動(dòng)范圍處于正常范圍，說(shuō)明疫苗具有較好的安全性。疫苗接種妊娠水貂未見有流產(chǎn)和死亡發(fā)生，進(jìn)一步說(shuō)明了疫苗的安全性。此外，為了驗(yàn)證培養(yǎng)介質(zhì)(微載體)在動(dòng)物體內(nèi)的安全性，在單劑量安全性實(shí)驗(yàn)組中設(shè)置微載體安全性評(píng)價(jià)組，通過(guò)觀察動(dòng)物臨床表現(xiàn)、監(jiān)測(cè)體溫變化，未發(fā)現(xiàn)異常，說(shuō)明微載體對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全性無(wú)明顯影響，這也是微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物新工藝開發(fā)的重要原因[4,13-14]。

綜上所述，基于懸浮工藝制備的水貂犬溫?zé)酼ero細(xì)胞活疫苗(CDV3-CL株，懸浮培養(yǎng))凍干品，具有很高的安全性，可以用于臨床防治水貂犬瘟熱疾病。