程雪飛，徐晶晶，武吉強(qiáng)，童 武，劉宇婷，朱豪杰，鄭 浩，童光志,2，李國新,2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

偽狂犬?。╬seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種危害多種野生動(dòng)物和家畜的急性傳染病。自2011年以來，PRV變異毒株的出現(xiàn)使我國許多疫苗免疫豬場發(fā)生了偽狂犬病[1]。本實(shí)驗(yàn)室把PRV變異株（JS-2012株）在Vero細(xì)胞上40℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)120代后，獲得了1株高度適應(yīng)Vero細(xì)胞的毒株（JS-2012-F120株），該毒株病毒滴度明顯提高，對豬和小鼠的毒力減弱[2]。測序結(jié)果顯示，在傳代過程中病毒基因組有多處基因缺失和突變[3]。gE是PRV主要的毒力基因，高溫傳代弱毒株（JS-2012-F120株）的gE至US2基因區(qū)域2307個(gè)堿基缺失被認(rèn)為是PRV毒力減弱的主要因素[2]。另外，UL46基因在1796位有29個(gè)堿基插入導(dǎo)致基因移碼突變，使3'端130個(gè)氨基酸突變[2-3]。

偽狂犬病病毒UL46為被膜蛋白，具體功能尚不清楚。在單純皰疹病毒I型中，UL46可與UL47被膜蛋白形成復(fù)合體，共同調(diào)控UL48（VP16）的表達(dá)[4-6]。缺失UL46的HSV-1可降低病毒的復(fù)制水平，噬斑變小[6-7]。UL46也可與UL48形成復(fù)合體，促進(jìn)病毒的釋放[8]。高溫傳代毒株（JS-2012-F120株）生物學(xué)特性的改變可能與UL46基因移碼突變相關(guān)[2-3]。為了研究UL46基因移碼突變對PRV體外復(fù)制和病毒毒力的影響，本研究通過同源重組技術(shù)用JS-2012-F120的UL46基因替換了JS-2012的UL46基因，構(gòu)建了重組病毒JS-2012-ΔUL46，并對該重組病毒、高溫傳代病毒株（JS-2012-F120株）及其親本強(qiáng)毒株（JS-2012株）在細(xì)胞上的生長特性及對小鼠毒力進(jìn)行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞偽狂犬病病毒變異株（JS-2012株）及其高溫傳代毒株（JS-2012-F120株）和Vero細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)試劑質(zhì)粒pBluescript SK(+)和pEGFP-C3由本實(shí)驗(yàn)室保存；LATaqwith GC Buffer購自寶生物（大連）有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM、2×MEM、胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS）和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）購自Gibco公司；病毒基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Fugene HD 轉(zhuǎn)染試劑和低熔點(diǎn)瓊脂購自Promega公司；EcoR I限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；同源重組酶clonExpress購自上海諾唯贊公司。

1.3 引物根據(jù)PRV JS-2012株（GeneBank登錄號：KP257591.1）和JS-2012-F120株（GeneBank登錄號：MG589642.1）基因組序列設(shè)計(jì)了擴(kuò)增UL46基因及其上游和下游同源臂的引物，同時(shí)設(shè)計(jì)了UL46替換之后的鑒定引物以及擴(kuò)增pEGFP-C3中表達(dá)的綠色熒光蛋白基因引物（表1）。

1.4 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建利用UL46上游臂-F/R、UL46-EGFP-F/R和UL46下游臂-F/R引物，擴(kuò)增JS-2012和JS-2012-F120 UL46基因的上游臂和下游臂的片段以及EGFP基因，利用UL46-EGFP-F120的上游和下游引物擴(kuò)增JS-2012 UL46基因的上游臂和下游臂及F120 UL46基因，將擴(kuò)增的片段與pBluescript SK(+)載體通過同源重組的方法連接，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pBluescript(SK+)-UL46-EGFP和pBluescript(SK+)-UL46-F120。構(gòu)建策略見圖1。

圖1 重組病毒構(gòu)建示意圖Fig.1 The schematic representation of recombinant virus

1.5 病毒基因組的提取將PRV接種于鋪有單層Vero細(xì)胞的T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞出現(xiàn)50%～60%病變時(shí)，棄去細(xì)胞上清，用PBS清洗1遍，刮取細(xì)胞收集于1.5 mL的離心管中，利用酚-氯仿異戊醇對病毒基因組進(jìn)行抽提，提取之后用RNAase-free water溶解，-20℃保存。

1.6 表達(dá)EGFP的重組載體JS-2012-EGFP的構(gòu)建將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移供體質(zhì)粒pBluescript(SK+)-UL46-EGFP和PRV（JS-2012）基因組共轉(zhuǎn)染鋪有單層Vero細(xì)胞的6孔板中，待2～3 d后細(xì)胞產(chǎn)生病變，收取細(xì)胞上清。將上清液稀釋到10-6，接種Vero細(xì)胞后1 h，棄去上清，然后鋪上含有2%FBS的低熔點(diǎn)瓊脂的培養(yǎng)基，室外放置30 min，再放置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2～3 d后挑取帶有綠色熒光的噬斑，置于無血清的DMEM中，于-20℃凍融1次后，再次接種Vero進(jìn)行下一輪噬斑純化，直至所有病變細(xì)胞都產(chǎn)生綠色熒光。

1.7 重組病毒vJS-2012-ΔUL46的構(gòu)建將獲得的表達(dá)EGFP的重組病毒vJS-2012-EGFP接種Vero細(xì)胞，按照1.5中的步驟提取病毒基因組，然后與構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移供體質(zhì)粒pBluescript(SK+)-UL46-F120共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，待2～3 d后產(chǎn)生細(xì)胞病變，收取細(xì)胞上清，進(jìn)行梯度稀釋鋪膠，挑取不含綠色熒光的病毒噬斑，置于DMEM中，凍融1次后再次接種于Vero細(xì)胞，進(jìn)行下一輪噬斑純化，每次純化之后需用PCR鑒定，將獲得的重組病毒命名為vJS-2012-ΔUL46。

1.8 重組病毒vJS-2012-EGFP和vJS-2012-ΔUL46的PCR鑒定將每輪挑取的噬斑接種于鋪滿Vero細(xì)胞的12孔板中，待細(xì)胞完全病變時(shí)，取250μL的上清液，按照天根生化科技（北京）有限公司病毒基因組提取試劑盒說明書提取DNA。以提取的DNA為模板，用46-EGFP鑒定-F/46-EGFP鑒定-R引物進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系：2×GC Buffer 10μL、LATaq0.25 μL、dNTP 2 μL、DNA模板1 μL、F/R（10 pmol/μL）0.5 μL、ddH2O 5.75 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸5 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂凝膠電泳，用凝膠成像儀觀察條帶大小。

1.9 病毒滴度的測定將PRV不同毒株接種于鋪滿Vero細(xì)胞的T75培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞完全病變時(shí)，將細(xì)胞和培養(yǎng)液凍于-80℃，然后溶解，將細(xì)胞上清于15 mL離心管500×g離心10 min，吸取上清分裝于1.5 mL離心管中。將收取的病毒上清液10倍倍比稀釋（10-1至10-9），接種于鋪滿Vero細(xì)胞的96孔板中，每個(gè)稀釋度接種8孔，最后留一列作為陰性和陽性對照，接種后48 h時(shí)，記錄細(xì)胞病變，按照Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.10 病毒的噬斑和一步生長曲線將PRV不同毒株以1 MOI的病毒量接種于鋪滿Vero細(xì)胞的T25培養(yǎng)皿中，分別在接種后6、12、18、24、30、36、42和48 h時(shí)收取細(xì)胞上清，測定TCID50。將病毒以103.0TCID50/mL的量接種于鋪滿Vero細(xì)胞的6孔板中，感作1 h時(shí)棄去細(xì)胞上清，然后進(jìn)行鋪膠，待2～3 d后，噬斑形態(tài)大小適中時(shí)采用龍膽紫溶液進(jìn)行染色，觀察噬斑形態(tài)。

1.11 病毒對小鼠的毒力40只6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)均分為4組，每組10只。第1～3組分別皮下接種100 μL的JS-2012、JS-2012-F120和JS-2012-ΔUL46，劑量為104.0TCID50/mL，第4組接種100 μL DMEM作為對照。攻毒后每天觀察小鼠的發(fā)病和死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 供體轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建分別對UL46基因的上游臂、下游臂和EGFP基因進(jìn)行擴(kuò)增，均獲得了相應(yīng)大小的目的條帶（圖略）。將回收片段連接至pBluescript SK (+)上，PCR鑒定結(jié)果顯示獲得了目的質(zhì)粒pBluescript (SK+)-UL46-EGFP（圖略）。

2.2 表達(dá)EGFP的重組病毒的構(gòu)建將2.1獲得的供體載體pBluescript (SK+)-UL46-EGFP與JS-2012的基因組共轉(zhuǎn)染鋪滿單層Vero細(xì)胞的6孔板中，待病變后挑取帶有熒光的噬斑。經(jīng)過5輪純化，獲得了缺失UL46 并含有EGFP 的重組病毒vJS-2012-EGFP（圖2A、2B）。經(jīng)PCR鑒定以及測序結(jié)果證實(shí)重組病毒構(gòu)建成功（圖2D）。

圖2 PRV vJS-2012-EGFP株和vJS-2012-ΔUL46株的噬斑純化及鑒定Fig.2 Plaque puri fication and identi fication of recombinant virus（vJS-2012-EGFP and vJS-2012-ΔUL46）

2.3 重組病毒株vJS-2012-ΔUL46的構(gòu)建將2.2中獲得的含有EGFP的vJS-2012-EGFP基因組與供體質(zhì)粒pBluescript (SK+)-UL46-F120共轉(zhuǎn)染于鋪有單層Vero細(xì)胞的6孔板中，按照1.7中所述方法篩選重組病毒，5輪純化后獲得無綠色熒光的重組病毒vJS-2012-ΔUL46（圖2C）。PCR鑒定結(jié)果顯示獲得的重組病毒均含有相對應(yīng)的目的片段（圖2E）。

2.4 重組病毒在細(xì)胞上的生長特性與強(qiáng)毒株JS-2012相比，高溫傳代弱毒株JS-2012-F120的噬斑減?。▓D3A），在細(xì)胞上的復(fù)制較快，第18 h和48 h病毒滴度分別達(dá)到3.9×107.0/mL和7.3×107.0TCID50/mL，遠(yuǎn)高于其親本株JS-2012的7.3×105.0/mL和5.1×106.0TCID50/mL（圖3B）。重組病毒株vJS-2012-ΔUL46的噬斑大小介于強(qiáng)毒株JS-2012和弱毒株JS-2012-F120間（圖3A），其生長趨勢與親本強(qiáng)毒株JS-2012無明顯差別，但病毒滴度遠(yuǎn)低于高溫傳代弱毒株JS-2012-F120（圖3B）。

2.5 重組病毒對小鼠的毒力PRV變異強(qiáng)毒株JS-2012接種后第3、4 d分別有6只、4只小鼠死亡，死亡率100%，平均死亡時(shí)間為3.4 d（圖4）；高溫傳代毒株JS-2012-F120接種后第6、7 d分別有8只、1只小鼠死亡，死亡率為90%，9只小鼠的平均死亡時(shí)間為6.1 d（圖4）；高溫傳代毒株的UL46基因替換JS-2012的UL46基因獲得的重組病毒株vJS-2012-ΔUL46接種后第3、4、5 d分別有5、4、1只小鼠死亡，死亡率為100%，平均死亡時(shí)間為3.6 d（圖4）。

3 討論

PRV UL46蛋白為被膜蛋白，位于病毒衣殼蛋白和囊膜蛋白之間，關(guān)于其功能性的研究很少有報(bào)道。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)UL46蛋白可以刺激ERK1/2的磷酸化進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的核膜降解（nuclear envelope break down，NEBD），從而使病毒從核隔室逃脫，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)最終成熟[9]。同屬于α皰疹病毒亞科的HSV-1 UL46功能研究相比較多，其中缺失UL46會使病毒的增殖能力下降；同時(shí)它可與細(xì)胞中的干擾素基因刺激蛋白相互作用，抑制I型干擾素的產(chǎn)生，促進(jìn)病毒的免疫逃逸[10]；當(dāng)細(xì)胞處于氨基酸缺乏以及UL46缺失的情況下，病毒本身不能復(fù)制增殖。當(dāng)恢復(fù)UL46基因時(shí)，它可以激活mTORC1受體，代償細(xì)胞氨基酸的缺損使病毒再次增殖[11]，可見UL46在病毒HSV-1復(fù)制和免疫逃逸過程中發(fā)揮著重要作用。

圖3 重組病毒及其親本毒株噬斑形態(tài)和一步生長曲線Fig.3 Plaque morphology and one step growth curve of the recombination virus and its parental virus in Vero

圖4 攻毒后小鼠的死亡情況Fig.4 Mortality of mice post infection with PRV

在前期的研究中發(fā)現(xiàn)高溫傳代細(xì)胞適應(yīng)毒株JS-2012-F120在細(xì)胞上的生長特性以及對小鼠的毒力的改變可能與UL46基因的移碼突變有關(guān)[3]。為了探討PRV UL46基因移碼突變對病毒在體內(nèi)外復(fù)制的影響，本研究用高溫傳代弱毒株JS-2012-F120的UL46基因替換了強(qiáng)毒株JS-2012的UL46基因構(gòu)建了重組病毒vJS-2012-ΔUL46株，并通過病毒噬斑和一步生長曲線觀察重組病毒的生長特性，通過小鼠感染試驗(yàn)觀察病毒毒力。與強(qiáng)毒株JS-2012相比，高溫傳代毒株JS-2012-F120病毒滴度明顯提高。這提示PRV強(qiáng)毒株經(jīng)Vero細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，高度適應(yīng)細(xì)胞，在細(xì)胞上的復(fù)制能力明顯增強(qiáng)。當(dāng)JS-2012的UL46基因被高溫傳代毒株JS-2012-F120的UL46基因替換后，重組病毒株vJS-2012-ΔUL46在細(xì)胞上的生長特性沒有出現(xiàn)明顯差別，只是噬斑略有減小，這提示單一的UL46移碼突變對野生變異毒株JS-2012在細(xì)胞中的生長影響不大，高溫傳代毒株JS-2012-F120在Vero細(xì)胞上復(fù)制能力增強(qiáng)可能是其他基因突變引起的或者是包括UL46在內(nèi)的多基因協(xié)同作用的結(jié)果。另一方面，高溫傳代毒株JS-2012-F120對小鼠的致死率為90%，低于強(qiáng)毒株JS-2012，小鼠的平均死亡時(shí)間（6.1 d）也遠(yuǎn)低于強(qiáng)毒株JS-2012（3.4 d）。這表明，PRV經(jīng)一系列高溫傳代后，對小鼠的毒力明顯減弱了。當(dāng)強(qiáng)毒株JS-2012的UL46基因被傳代毒株JS-2012-F120的UL46基因替換后，重組病毒vJS-2012-ΔUL46對小鼠的致死率依然為100%，但小鼠的平均死亡時(shí)間（3.6 d）低于強(qiáng)毒株JS-2012（3.4 d）。重組病毒株JS-2012-ΔUL46對小鼠的毒力介于強(qiáng)毒株JS-2012和傳代毒株JS-2012-F120之間，這提示UL46基因移碼突變使PRV對小鼠的毒力減弱了。小鼠對PRV的感染特別敏感，104.0TCID50/mL強(qiáng)毒株可以使小鼠在感染后第3～4 d全部死亡，同樣劑量的重組病毒株vJS-2012-ΔUL46使小鼠在感染后第3～5 d死亡，其毒力更接近強(qiáng)毒株，而遠(yuǎn)強(qiáng)于傳代毒株。這提示UL46移碼突變對于傳代毒株毒力減弱只是起到了次要的作用。