李巧燕，譚子龍，靳元春，何 鑫，柳亦松，劉 偉

（1.湖南省郴州市資興市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，郴州 423400；2.易聯(lián)生物科技有限公司，廣州 510623；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128）

小吻對盲囊線蟲（Contracaecum osculatum）是屬于異尖科的寄生線蟲，其中間宿主可為多種甲殼類動物，主要寄生在目魚、鱈魚、海豚等海洋哺乳動物體內(nèi)，同時也可感染其他捕食魚類（包括人類）的哺乳動物[1-3]。小吻對盲囊線蟲感染人的報道較少，以第三期幼蟲為主，通過寄生于人體消化道各部位，引發(fā)內(nèi)臟幼蟲移行癥，導(dǎo)致宿主胃腸不適，感染嚴(yán)重者表現(xiàn)為進食后數(shù)小時腹部突發(fā)劇痛，對人類健康具有潛在危害[4-5]。因此，正確鑒別小吻對盲囊線蟲，不僅具有重要學(xué)術(shù)價值，對該病的預(yù)防和社會公共衛(wèi)生也具有重要意義。

傳統(tǒng)的寄生蟲鑒定方法主要依據(jù)是形態(tài)學(xué)鑒定，但隨著時間的推移和生物種群的進化，形態(tài)學(xué)鑒定局限性愈加明顯，即難以對相似種和近緣物種進行準(zhǔn)確的鑒別[6]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，選擇合適的基因作為標(biāo)記可以更好的探究寄生蟲的遺傳變異情況，為此問題的解決開辟了新的途徑[7-8]。線粒體DNA（mtDNA）是一種核外遺傳物質(zhì)，與核DNA相比，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進化速率快、母系遺傳等優(yōu)點，近年來越來越多的被學(xué)者應(yīng)用于寄生蟲的種類鑒定和遺傳發(fā)育關(guān)系研究[9-10]。本研究以湖南省不同地區(qū)黑斑蛙體內(nèi)采集到的小吻對盲囊線蟲分離株為研究對象，利用PCR方法對其pcox1基因序列進行擴增和序列分析，從而明確小吻對盲囊線蟲線粒體pcox1基因序列能否成為理想的種間遺傳標(biāo)記，為小吻對盲囊線蟲的分類鑒別和分子流行病學(xué)調(diào)查等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣品16個黑斑蛙小吻對盲囊線蟲樣品分別采自湖南省常德（CD1-2）、溆浦（XP1-2）、宜章（YZ1-2）、張家界（ZJJ1-2）、株洲（ZZ1-2）、耒陽（LY1-2）、長沙（CS1-2）、邵陽（SY1-2），所采集樣品均來自于黑斑蛙胃部。

1.2 主要試劑Taq酶及相關(guān)試劑購自TaKaRa公司，蛋白酶K購自Merck公司，WizardTMDNA Cleanup System試劑盒購自Promega公司，基因組DNA提取試劑盒（Wizard SV Genomic DNA Purification System）購自Promega公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。

1.3 樣品保存及形態(tài)學(xué)鑒定取樣品放入0.9%生理鹽水中，讓蟲吐出食道中的殘余物。從所采取的蟲體中選擇幾條形態(tài)完整蟲體保存入甘油溶液中，其余的全部放入70%的酒精中保存?zhèn)溆?。完成線蟲乳酸甘油透明步驟，將制作好的標(biāo)本放在顯微鏡下進行觀察，根據(jù)蟲體的頭部、尾部形態(tài)來確定蟲的種類。參考相關(guān)文獻[11]，進行初步形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4 樣品DNA的制備每個成蟲截取蟲尾一小段，用ddH2O反復(fù)沖洗4次，分別置于1.5 mL離心管中，用滅菌的微型剪刀將蟲體剪碎，分別加入30 μL蛋白酶K（50 μg/μL）和270 μL SDS裂解液，混勻后置于55℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜消化。用Promega公司的DNA抽提試劑盒提取蟲體DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的DNA片段擴增利用DNA提取試劑盒提取70%酒精保存的小吻對盲囊線蟲基因組DNA，以其為模板，按照文獻[12]等設(shè)計合成的1對引物（上游引物：5'-TTTTT TGGGC ATCCT GAGGT TTAT-3'，下游引物：5'-TAAAG AAA GA ACATA ATGAA AATG-3'）進行cox1基因片段的PCR擴增。反應(yīng)體系為50 μL；擴增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，預(yù)期擴增片段約為400 bp。

1.6 cox1基因片段序列測定和序列分析PCR擴增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司直接測序，利用DNAStar 5.0軟件進行分析，并與GenBank中登錄的代表性小吻對盲囊線蟲cox1序列進行比較，利用Clustal X2.0及Mega 4.1軟件對擴增的cox1序列進行比對，并利用Mega 4.1程序中的臨接法（Neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建種系發(fā)育樹。臨接法在軟件默認(rèn)設(shè)置下進行分析；同時利用DNAStar 5.0中的Megalign程序進行序列相似性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定前唇瓣具雙叉的齒狀嵴，間唇付缺；食道具有長方形的腺質(zhì)的后端膨大，無膨大部的突起或盲腸；雄蟲尾部鈍圓、錐形，有許多肛前乳突和數(shù)對肛后乳突，交合刺等長或不等長；雌蟲陰門位于體前部，卵較小（圖1）。基于上述形態(tài)學(xué)特點，初步判定湖南省8個地區(qū)16個樣品為同一物種，初步定為小吻對盲囊線蟲。

圖1 小吻對盲囊線蟲形態(tài)學(xué)Fig.1 The morphology of Contracaecum osculatum

2.2 PCR擴增結(jié)果及序列分析對16個黑斑蛙小吻對盲囊線蟲樣品中8個代表性樣品均成功地擴增出約400 bp pcox1的條帶，與預(yù)期目的片段大小一致，且無非特異性條帶，陰性對照未擴增出條帶（圖2）。

圖2 小吻對盲囊線蟲線粒體pcox1 PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.2 Ampli fication of mtDNA pcox1 gene fragment from frog Contracaecum osculatum by PCR

擴增產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，湖南省的16個分離株cox1基因擴增序列均為394 bp。樣品序列與GenBank中收錄的小吻對盲囊線蟲pcox1基因序列（GenBank登錄號：AJ405310.1）進行比較，相似性為92.1%～93.4%，其中樣品CD-1、CD-2、XP-1、XP-2、ZZ-1、ZZ-2、LY-1、LY-2與其相似度最高，為93.4%。與肝片吸蟲（GenBank登錄號：GU112485.1）、類圓線蟲（GenBank登錄號：AB526290.1）進行種間比較，相似度則較低，為32.1%～53.2%。

2.3 pcox1基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹利用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹（圖3），結(jié)果顯示，16個黑斑蛙小吻對盲囊線蟲分離株與GenBank上報道的小吻對盲囊線蟲（GenBank登錄號：AJ405310.1）位于同一支，小吻對盲囊線蟲分離株與其他線蟲所屬分支相隔較遠，能夠十分明顯的區(qū)分開來，系統(tǒng)發(fā)生樹中的Bootstrap值較高，得到了很好的鑒別。

圖3 基于pcox1基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Bootstrap consensus phylogram of the stationary tree reconstructed by NJ using the pcox1 sequences

本研究通過對湖南省不同地區(qū)蛙體內(nèi)小吻對盲囊線蟲16個樣品的pcox1基因序列分析發(fā)現(xiàn)，與已報道的小吻對盲囊線蟲序列的相似度為92.1%～93.4%；將小吻對盲囊線蟲的16個樣品的pcox1序列進行種內(nèi)比較，發(fā)現(xiàn)其種內(nèi)差異為6.6%～7.9%，而種間的差異為46.8%～67.9%；蛙體內(nèi)的小吻對盲囊線蟲mtDNAcox1基因序列的種間差異大于種內(nèi)差異。從以上結(jié)果可以初步判斷蛙小吻對盲囊線蟲線粒體pcox1基因序列可作為分子遺傳標(biāo)記用于其種（株）之間的分類和鑒定。

對所獲得的小吻對盲囊線蟲的序列進行了系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)湖南省黑斑蛙小吻對盲囊線蟲16株分離株與GenBank上報道的小吻對盲囊線蟲屬同一枝。從分子進化的角度看，與我們的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果完全一致。同時也進一步說明mtDNAcox1基因序列可作為蛙小吻對盲囊線蟲（株）之間的分類和鑒定的分子遺傳標(biāo)記。

本試驗闡明湖南省8個地區(qū)黑斑蛙小吻對盲囊線蟲序列的進化與變異情況，填補了相關(guān)研究的空白，并利用計算機模型進行了差異性分析和系統(tǒng)進化分析，為下一步黑斑蛙寄生蟲病、分子遺傳學(xué)和診斷學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，同時也為其他寄生蟲病研究提供了方法學(xué)參考。