李 蕾， 吳 希， 許冠群， 梁 茜， 戴 菁， 武文漫， 丁秋蘭， 王鴻利， 王學(xué)鋒,3

(1．上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 醫(yī)學(xué)基因組國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海血液學(xué)研究所，上海 200025；2．上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025；3．上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，上海 200025）

易栓癥是指由于遺傳性或獲得性原因?qū)е聶C(jī)體容易發(fā)生血栓的一種病理生理過(guò)程，臨床上以靜脈血栓（venous thromboembolism,VTE）更為多見(jiàn)，如下肢深靜脈血栓、肺栓塞等[1]。遺傳性易栓癥占易栓癥的30%～50%，其中的抗凝血酶（antithrombin,AT）、蛋白 C（protein C，PC）和蛋白 S（protein S，PS）缺陷是我國(guó)VTE人群最主要的遺傳性危險(xiǎn)因素[2-4]，此外，編碼凝血因子、纖溶蛋白、富組氨酸糖蛋白等的基因發(fā)生突變也可能會(huì)引起易栓傾向[5-8]。由于遺傳性危險(xiǎn)因素?cái)y帶終生，對(duì)其進(jìn)行明確診斷對(duì)患者及其家系成員有效的抗凝治療及VTE預(yù)防具有重要意義。

傳統(tǒng)的遺傳性易栓癥診斷主要依賴表型檢測(cè)，當(dāng)表型檢測(cè)結(jié)果異常時(shí)，再針對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行以一代測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的基因檢測(cè)，尋找是否存在致病突變。然而，表型診斷有諸多局限性，如只能檢測(cè)血漿中的蛋白成分，當(dāng)患者處于血栓急性期或口服抗凝藥物期間會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，且表型檢測(cè)由于方法學(xué)上的局限性，很難反映被檢蛋白的全部情況[1]，且有些VTE發(fā)生相關(guān)的蛋白尚無(wú)有意義的表型檢測(cè)方法，如血栓調(diào)節(jié)蛋白、內(nèi)皮細(xì)胞PC受體、肝素輔因子Ⅱ等[9-11]。目前，不斷有新的遺傳性血栓危險(xiǎn)因素被報(bào)道[12]，基因拷貝數(shù)變異（copy number variation,CNV）也被證實(shí)與血栓的發(fā)生密切相關(guān)[13-14]，這提示傳統(tǒng)的遺傳性易栓癥診斷方式已無(wú)法滿足現(xiàn)階段的臨床診斷需求。

新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為易栓癥遺傳背景檢測(cè)打開(kāi)了新的局面，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)多個(gè)基因或目的區(qū)域進(jìn)行快速有效地基因檢測(cè)。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院設(shè)計(jì)了適用于我國(guó)VTE患者的易栓癥基因檢測(cè)Panel，共包含了18種與血栓發(fā)生相關(guān)的候選基因，采用二代測(cè)序和CNVplex?技術(shù)對(duì)基因的編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變、小缺失或插入及CNV的檢測(cè)，結(jié)合生物信息學(xué)手段對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行深度分析，進(jìn)而確定相關(guān)基因的變異情況。本研究利用該P(yáng)anel對(duì)前期收集的VTE患者進(jìn)行了基因檢測(cè)，不僅驗(yàn)證了該P(yáng)anel應(yīng)用于臨床診斷的可行性，同時(shí)調(diào)查了我國(guó)VTE患者的遺傳背景。

資料與方法

一、臨床資料

收集2015年1月至2018年6月期間就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院血栓與止血門診、并經(jīng)影像學(xué)方法檢測(cè)（多普勒超聲、靜脈造影及肺動(dòng)脈CT等）確診患有VTE的患者[3]，這些患者來(lái)自我國(guó)各地，以華東和華南地區(qū)為主,絕大多數(shù)為漢族人，通過(guò)對(duì)其病史、家族史等進(jìn)行評(píng)估，篩選出發(fā)病年齡＜50歲或復(fù)發(fā)型VTE或罕見(jiàn)部位（上肢深靜脈血栓、淺靜脈血栓、顱內(nèi)靜脈竇血栓及門靜脈系統(tǒng)血栓等）的VTE患者，同時(shí)排除處于腫瘤活動(dòng)期的患者，最終本研究共納入246例VTE患者。

二、方法

1.易栓癥的表型檢測(cè)：采集患者的靜脈血，置于 1∶9抗凝的枸櫞酸鈉抗凝管中，2 000×g離心15 min分離血漿和血細(xì)胞。采用ACL-TOP全自動(dòng)血凝儀（IL公司,美國(guó)）對(duì)患者血漿中的凝血因子、抗凝蛋白、纖溶蛋白及狼瘡抗凝物進(jìn)行檢測(cè)，其中凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ及 PS活性采用凝固法測(cè)定；血管性血友病因子抗原及活性測(cè)定采用免疫比濁法，AT、PC和纖溶酶原活性采用發(fā)色底物法測(cè)定；狼瘡抗凝物采用稀釋的蝰蛇毒時(shí)間法測(cè)定；抗心磷脂抗體和抗β2糖蛋白Ⅰ采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定。

2.易栓癥基因檢測(cè)Panel：遺傳性易栓癥可由多種基因突變導(dǎo)致。本研究主要檢測(cè)VTE患者的抗凝蛋白、凝血因子及纖溶相關(guān)蛋白等是否存在基因突變導(dǎo)致其功能障礙。根據(jù)目前已知的文獻(xiàn)報(bào)道[15]，全基因組關(guān)聯(lián)分析證實(shí)有17種基因與靜脈血栓發(fā)生相關(guān)；本研究又通過(guò)在人類孟德?tīng)栠z傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù) （Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）中檢索“thrombophilia”、“venous thromboembolism”及“deep venous thrombosis”等關(guān)鍵詞，最終遴選出18種與易栓癥或靜脈血栓發(fā)生相關(guān)的基因，組成了易栓癥基因檢測(cè)Panel（見(jiàn)表1）。突變篩查涉及到2種高通量檢測(cè)技術(shù)，其中點(diǎn)突變或小缺失/插入的檢測(cè)使用以新一代測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的目的區(qū)域富集測(cè)序技術(shù)，而CNV的檢測(cè)采用CNVplex?高通量拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)。

（1）多重目的區(qū)域富集測(cè)序及分析：采用Fast-TargetTM富集技術(shù)（天昊生物科技，上海），針對(duì)18種基因的啟動(dòng)子區(qū)域、5′和3′非編碼區(qū)、編碼區(qū)、剪切位點(diǎn)附近序列設(shè)計(jì)多重PCR擴(kuò)增體系，富集目的片段；再利用Illumina Hiseq測(cè)序儀 （Illumina，美國(guó)）的2×150 bp測(cè)序模式對(duì)目的片段進(jìn)行雙向測(cè)序驗(yàn)證；最后，通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行測(cè)序深度分析[16]。在檢出的基因變異中，先去除在dbSNP135數(shù)據(jù)庫(kù)中有記錄或在千人基因組項(xiàng)目里面我國(guó)漢族人群中的頻率≥1%的單核苷酸變異；然后采用 PolyPhen-2、SIFT和MutationTaster軟件對(duì)非同義單核苷酸變異的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，如果2個(gè)及以上軟件認(rèn)為突變具有致病性，即將該突變歸為致病突變；剪切位點(diǎn)突變采用Alamut v2.7對(duì)正常剪切的影響進(jìn)行預(yù)測(cè)，如果2個(gè)及以上軟件認(rèn)為突變具有致病性，則將其歸為致病突變；最后，篩選出的突變通過(guò)一代測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)而確定樣品中易栓癥相關(guān)基因的外顯子、剪切點(diǎn)區(qū)域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的點(diǎn)突變變異情況。

（2）CNVplex?高通量拷貝數(shù)檢測(cè)：采用CNVplex?高通量拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)（天昊生物科技，上海）對(duì)上述18種基因的目的區(qū)域進(jìn)行高通量CNV檢測(cè)。首先，采用連接酶高特異性連接反應(yīng)對(duì)上述目的區(qū)域進(jìn)行雜交、連接，通過(guò)在連接探針末段引入不同長(zhǎng)度的標(biāo)簽序列獲得長(zhǎng)度各異的目的探針連接產(chǎn)物，利用熒光標(biāo)記的通用引物對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)熒光毛細(xì)管電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離檢測(cè)，最后通過(guò)對(duì)電泳圖譜的分析獲取各個(gè)位點(diǎn)的峰高，進(jìn)而對(duì)樣品目的區(qū)域的拷貝數(shù)進(jìn)行分析確定。

3.生物學(xué)意義分析：參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)對(duì)基因變異致病性的分類標(biāo)準(zhǔn)[17]，已有文獻(xiàn)報(bào)道與VTE發(fā)病有關(guān)的突變定義為“致血栓”的突變；新的點(diǎn)突變、剪切位點(diǎn)突變，結(jié)合軟件預(yù)測(cè)結(jié)果及表型結(jié)果，顯示相關(guān)蛋白功能異常且與VTE相關(guān)時(shí)，可將其歸類為“致血栓”的突變。其他與VTE無(wú)明確相關(guān)性的基因變異定義為“致病性不明確”的變異。

表1 易栓癥基因檢測(cè)Panel包含的18種基因

結(jié) 果

一、對(duì)象的基本資料

本研究納入246例VTE患者，男性173例，女性 73例，首次發(fā)病年齡為（34.3±13.2）歲。 46.3%（114/246）的患者曾反復(fù)發(fā)生VTE，約25%的患者伴有獲得性血栓危險(xiǎn)因素，如抗磷脂綜合征、外科手術(shù)、長(zhǎng)期臥床或妊娠等。

二、篩查對(duì)象的基因檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)易栓癥基因檢測(cè) Panel發(fā)現(xiàn)，64.6%（159/246）的患者攜帶基因突變，其他87例患者未檢測(cè)到突變。在攜帶突變的患者中，69.2%（110/159）攜帶單一基因突變，13.2%（21/159）攜帶單基因的復(fù)合雜合突變，17.6%（28/159）攜帶2種及以上的基因突變 （見(jiàn)圖1）。根據(jù)突變類型分類，88%（140/159）的患者僅攜帶點(diǎn)突變、小缺失或插入，5.7%（9/159）的患者僅攜帶基因拷貝數(shù)變異，另外6.3%（10/159）的患者兩者均攜帶。

圖1 246例靜脈血栓栓塞患者的易栓癥基因檢測(cè)Panel結(jié)果

本研究建立的易栓癥基因檢測(cè)Panel中，有6種基 因 （PROCR、THBD、SERPIND1、TFPI、HRG 和ADAMTS13）目前尚缺乏有意義的表型指標(biāo)，只能通過(guò)基因檢測(cè)、生物信息學(xué)分析及體外實(shí)驗(yàn)對(duì)其功能進(jìn)行分析。其次，有72例患者因處于血栓急性期或口服抗凝藥物期間，無(wú)法進(jìn)行表型檢測(cè)，經(jīng)易栓癥基因檢測(cè)Panel分析發(fā)現(xiàn)，其中32例患者攜帶致病性基因突變。另有56例患者的實(shí)驗(yàn)室表型檢測(cè)結(jié)果均為正常，而易栓癥基因檢測(cè)Panel結(jié)果顯示其中20例患者攜帶致病性基因突變。

1.攜帶單基因單個(gè)突變患者的表型及基因檢測(cè)結(jié)果：本研究中共有110例患者攜帶單一基因突變，平均年齡為（33.7±12.6）歲，其中半數(shù)的患者曾多次發(fā)生VTE，四分之一的患者合并獲得性血栓危險(xiǎn)因素，如抗磷脂綜合征、妊娠或外科手術(shù)等。如表2所示，96例患者攜帶抗凝蛋白突變，其中90例患者攜帶點(diǎn)突變、小缺失或插入，6例患者攜帶基因拷貝數(shù)變異?？鼓鞍淄蛔冎杏?1個(gè)突變?yōu)槭状伟l(fā)現(xiàn)，經(jīng)表型驗(yàn)證均為致血栓性突變。另外，有5例患者攜帶凝血因子突變，其中有1例年輕男性患者，反復(fù)發(fā)生VTE，家族史陽(yáng)性，但易栓癥表型檢測(cè)均未發(fā)現(xiàn)異常，經(jīng)易栓癥基因Panel檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其攜帶F2基因Arg596Gln突變 （已有研究表明該突變導(dǎo)致抗凝血酶抵抗，是VTE的嚴(yán)重危險(xiǎn)因素[18-19]）。還有一例14歲的VTE患者攜帶F9基因Arg384Gln突變 （體外研究表明該突變導(dǎo)致凝血因子Ⅸ活性顯著升高，為VTE的危險(xiǎn)因素之一）。此外，還有2例F5突變、1例F12突變、4例PROCR突變、2例THBD突變、2例SERPIND1突變和1例PLG突變的致病性需要進(jìn)一步行功能性實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證。

表2 攜帶單基因單個(gè)突變患者的表型及基因檢測(cè)結(jié)果（n）

2.攜帶單基因復(fù)合雜合突變患者的表型及基因檢測(cè)結(jié)果：本研究中有21例患者攜帶單基因復(fù)合雜合突變（見(jiàn)表 3），首次發(fā)病年齡為（31.4±11.5）歲，81%的患者曾發(fā)生無(wú)明顯誘因的VTE事件，57%的患者曾反復(fù)發(fā)生VTE。有17例患者為PROC復(fù)合雜合突變，PC活性在15%至90%之間，其中有14例患者攜帶中國(guó)人群的PROC熱點(diǎn)突變 （R189W或K192del）。另外，有4例患者攜帶PROS1復(fù)合雜合突變，PS活性顯著下降 （18%～38%），其中3例攜帶中國(guó)人群的PS熱點(diǎn)突變（E67A或R561W）。在這21例患者中，共有11例患者攜帶新的基因突變，包括8種PROC新突變和3種PROS1新突變，通過(guò)對(duì)患者家系中攜帶相同突變的成員進(jìn)行表型驗(yàn)證后證實(shí)，以上新突變均會(huì)導(dǎo)致受累者的PC或PS活性下降，為致血栓性突變。家系調(diào)查顯示，以上患者所攜帶的復(fù)合雜合突變均來(lái)源于其父母。

表3 攜帶單基因復(fù)合雜合突變患者的表型及基因檢測(cè)結(jié)果

3.攜帶多種基因突變患者的表型及基因檢測(cè)結(jié)果：本研究建立的易栓癥基因檢測(cè)Panel的結(jié)果顯示，共有28例患者攜帶多種基因的突變，首次發(fā)病年齡為 （32.0±13.3）歲。16例患者曾反復(fù)發(fā)生VTE，其中6例伴有獲得性血栓危險(xiǎn)因素。在這些患者中，抗凝蛋白聯(lián)合缺陷最為常見(jiàn)（11/28），其中PROC合并PROS1突變的比例最高（7/28），受累患者的PS活性均顯著降低，但有5例患者的PC活性處于正常水平。其次，有3例患者同時(shí)攜帶SERPINC1和PROC突變，1例患者攜帶SERPINC1合并PROS1突變，除了SERPINC1新突變Met313Thr致病性尚不明確，其他突變均為致血栓性突變。另有10例抗凝蛋白缺陷患者攜帶合并PROCR突變，抗凝蛋白的表型檢測(cè)證實(shí)所有突變均為致病性突變，但PROCR突變（Pro145Leu和1～3號(hào)外顯子重復(fù)）的致病性仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。除此之外，有1例PC缺陷患者合并PLG基因1～2號(hào)外顯子雜合缺失，該突變導(dǎo)致PLG活性降至正常水平的50%。另有1例男性患者同時(shí)攜帶PROC純合突變（c.-148T>C）、F12 純合突變（Gly473Arg）和F2雜合子突變（His479Arg），PROC突變導(dǎo)致其PC活性嚴(yán)重降低，僅為正常水平的14%，凝血因子Ⅻ和Ⅱ的活性分別為15%和75%。此外，有4例患者攜帶抗凝蛋白缺陷合并THBD、TFPI或ADAMTS13等新突變，這些突變的致病性需要進(jìn)一步行功能性實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證。

4.未找到基因突變的患者：本研究納入246例VTE患者中，有87例患者未找到基因突變（結(jié)果未顯示）?；颊叩氖状伟l(fā)病年齡為（36.53±14.15）歲，其中，35.6%（31/87）的患者曾反復(fù)發(fā)生VTE。21例患者的VTE發(fā)生有明顯誘因，其中7例患者的狼瘡抗凝物或抗心磷脂抗體呈陽(yáng)性，其他誘因包括外科手術(shù)、長(zhǎng)期臥床或妊娠等。

表4 攜帶多種基因突變患者的表型及基因檢測(cè)結(jié)果

討 論

一、易栓癥的基因檢測(cè)適用人群

易栓癥的臨床檢測(cè)指南建議，易栓癥的遺傳性危險(xiǎn)因素檢測(cè)應(yīng)在臨床醫(yī)師的建議下有選擇性地進(jìn)行，如當(dāng)患者反復(fù)發(fā)生VTE、有VTE家族史或患者年齡較小且為無(wú)明顯誘因下發(fā)生VTE才應(yīng)進(jìn)行遺傳篩查；而對(duì)于有明顯誘因或僅發(fā)生單次VTE的患者，可以不進(jìn)行遺傳篩查[20-21]。然而，本研究通過(guò)評(píng)估患者病史，篩選出年輕時(shí)發(fā)生VTE及反復(fù)VTE的患者進(jìn)行遺傳篩查，對(duì)是否合并誘發(fā)因素及家族史沒(méi)有嚴(yán)格要求，而基因檢測(cè)結(jié)果顯示，在61例存在獲得性血栓危險(xiǎn)因素（抗磷脂綜合征、手術(shù)或妊娠等）的患者中有40例患者攜帶遺傳性血栓危險(xiǎn)因素，提示對(duì)存在獲得性危險(xiǎn)因素的患者進(jìn)行遺傳分析也同樣有必要的。嚴(yán)格的入組標(biāo)準(zhǔn)可以提高突變檢出率，但也會(huì)造成部分患者漏診，這應(yīng)該引起臨床醫(yī)師及檢驗(yàn)人員的高度重視，并在實(shí)踐中進(jìn)一步探討基因診斷的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

二、易栓癥的測(cè)序檢測(cè)

隨著新一代測(cè)序技術(shù)的普及和測(cè)序成本的降低，部分實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始采用全基因組測(cè)序或全外顯子測(cè)序進(jìn)行易栓癥基因檢測(cè)，而這些測(cè)序方法會(huì)得到海量信息，對(duì)其分析的過(guò)程復(fù)雜而繁瑣。本研究的易栓癥基因檢測(cè)Panel精選了18種與中國(guó)人群VTE發(fā)生相關(guān)的基因，檢測(cè)針對(duì)性更強(qiáng)，準(zhǔn)確率更高，成本更低。發(fā)現(xiàn)基因變異的患者，待其VTE急性期或治療結(jié)束后1個(gè)月后進(jìn)行表型檢測(cè)，或者對(duì)其攜帶相同突變的家系成員進(jìn)行表型檢測(cè)以確定基因變異的致病性。易栓癥的基因診斷結(jié)合表型診斷，為明確血栓病因提供了科學(xué)證據(jù)，也為臨床制訂個(gè)體化抗凝措施提供了理論依據(jù)，為先證者家族成員提供早期診斷和臨床前預(yù)防依據(jù)。

本研究通過(guò)易栓癥基因Panel檢測(cè)對(duì)246例VTE患者進(jìn)行篩查后發(fā)現(xiàn)，有31例患者攜帶抗凝蛋白以外的基因突變，19例患者攜帶易栓癥基因的拷貝數(shù)變異，這些突變?cè)趥鹘y(tǒng)的血栓篩查很難被檢測(cè)出來(lái)。如有1例男性患者從25歲開(kāi)始反復(fù)發(fā)生VTE，其家族史陽(yáng)性，但易栓癥表型檢測(cè)及抗凝蛋白一代測(cè)序均未發(fā)現(xiàn)異常，經(jīng)易栓癥基因Panel檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其攜帶F2基因Arg596Gln突變，該突變是VTE的嚴(yán)重危險(xiǎn)因素[18-19]。另外，有28例患者被檢出攜帶多個(gè)基因的突變，攜帶多個(gè)抗凝蛋白突變的患者一般比攜帶單個(gè)抗凝蛋白突變的患者的臨床癥狀更為嚴(yán)重，而一些患者攜帶多個(gè)突變可能減輕血栓的嚴(yán)重程度。如本研究中有1例男性患者同時(shí)攜帶PROC純合突變、F12純合突變和F2雜合子突變。通常來(lái)說(shuō)，純合的PC缺陷很有可能是致命的，通常在新生兒期就會(huì)出現(xiàn)廣泛的VTE或暴發(fā)性紫癜，然而該患者的PC活性雖然僅為15%，但其在23歲才第一次發(fā)生VTE，這可能是因?yàn)镕12和F2的突變導(dǎo)致凝血因子Ⅻ和Ⅱ活性降低，削弱了患者的凝血功能，從而減弱了PC活性明顯降低引起的血栓形成效應(yīng)。以上結(jié)果表明，本研究建立的易栓癥基因檢測(cè)Panel對(duì)篩選VTE患者的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素是靈敏且有效的，可使VTE的基因檢測(cè)更加全面。

在87例未找到基因突變的患者中，有9例患者曾發(fā)生3次及3次以上VTE，有5例患者有VTE家族史，本研究仍懷疑這些患者是否有遺傳性血栓危險(xiǎn)因素。目前，本研究對(duì)易栓癥基因檢測(cè)Panel進(jìn)行了補(bǔ)充，新增了17種基因，涉及纖維蛋白原異常、血管性血友病、骨髓增殖性疾病、血小板功能亢進(jìn)等，將對(duì)未找到突變的患者進(jìn)一步進(jìn)行篩查。

總之，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院開(kāi)發(fā)的易栓癥基因檢測(cè)Panel可以更加快速、準(zhǔn)確且有效地對(duì)遺傳性血栓危險(xiǎn)因素進(jìn)行篩查。臨床可根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果，預(yù)判遺傳風(fēng)險(xiǎn)的大小，為患者制定相應(yīng)的預(yù)防治療方案和療程，預(yù)防血栓的發(fā)生或復(fù)發(fā)，減少血栓后綜合征的發(fā)生，值得在臨床上廣泛推廣及應(yīng)用。