馬麥艷　張相鋒　焦子偉

摘要利用前期加速溶劑萃取法提取腺苷、蟲草素的優(yōu)化結(jié)果，分別挑選最優(yōu)處理進(jìn)行試驗(yàn)，即提取腺苷最適條件為溫度70C、時(shí)間10min、乙醇含量20%、循環(huán)2次，提取蟲草素最適條件為溫度1009C、時(shí)間15min、乙醇含量0%.循環(huán)2次。并將該方法與水熱回流法、醇熱回流法、超聲水提法、超聲醇提法4種傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，加速溶劑萃取法明顯優(yōu)于其他傳統(tǒng)4種方法，各個(gè)方法之間差異達(dá)顯著水平（P<0.05）;加速溶劑蓽取法提取腺苷效果最好，提取量為2118.07μg/g，提取效果最差的是超聲波醇提法，提取量?jī)H有180.72μg/g;加速溶劑萃取法提取的蟲草素量為19678.70μg/g，超聲波醇提法提取蟲草素效果最差，提取量?jī)H有4108.27μg/g;加速溶劑萃取法有其明顯的優(yōu)勢(shì)，操作簡(jiǎn)單、方便快捷。

關(guān)鍵詞 蛹蟲草;加速溶劑萃取法;蟲草素;腺苷;成分提取

中圖分類號(hào) TS264.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-5739（2019）05-0220-03

蟲草素（Cordycepin），全稱3一脫氧腺苷，分子式為C.gH3N，O3，是核苷類的一種，pH值偏堿性，常溫下是固態(tài)晶體，性狀為片狀或針狀，其熔點(diǎn)為230～231C"，溶于水、熱乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿等有機(jī)溶劑，紫外光最大吸收波長(zhǎng)為259nm！2。腺苷也是核苷類的一種，具有抑制中樞神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、改善心腦血液循環(huán)等作用34。一般提取蟲草素的方法都能一并獲得腺苷，已報(bào)道的傳統(tǒng)提取方法有浸提法、超聲法、索氏提取法、回流法、滲漉提取法等15日。鐘艷梅等叫以人工蛹蟲草固定培養(yǎng)殘基為原料，采用索式提取法提取蟲草素，結(jié)果表明，水比乙醇更利于提取蟲草素。王英娟等8也采用超聲法、回流法與提取溶劑水.乙醇組合的4種提取方法獲得蟲草素，結(jié)果表明，水熱回流法效果最佳。譚琪明等后續(xù)采用傳統(tǒng)的高溫水浴提取技術(shù)獲得蛹蟲草小麥培養(yǎng)基中的蟲草素，提取率為94.87%，進(jìn)一步說明了水提取蟲草素的優(yōu)勢(shì)，超聲波提取法也是一種傳統(tǒng)方法，張嘉等叫通過比較不同方法得出超聲波提取法的提取效果最好。快速溶劑萃取儀（Accelerated?Solvent?Extraction，ASE）1-19，是利用溶劑對(duì)固體、半固體的樣品進(jìn)行萃取16，近幾年，在國(guó)內(nèi)外均有利用ASE提取天然活性成分的研究，但利用加速溶劑萃取法提取蛹蟲草中蟲草素及腺苷尚未見報(bào)道。目前，蟲草素分離純化是研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域，本文利用前期對(duì)加速溶劑萃取法提取蟲草素、腺苷優(yōu)化結(jié)果，在此基礎(chǔ)上，分別挑選提取腺苷和蟲草素最好的處理，與水熱回流法醇熱回流法、超聲水提法、超聲醇提法4種傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，確定最佳的提取工藝方法。通過用HPLC測(cè)定蟲草素含量來比較各個(gè)方法的優(yōu)劣，以期為伊犁乃至新疆地區(qū)蛹蟲草主要活性物質(zhì)的提取提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株。蛹蟲草為本實(shí)驗(yàn)室人工培育，蟲草素及腺苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

1.1.2供試試劑。乙醇（C2HsoH），分析純，購(gòu)自德州潤(rùn)昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;乙腈（C2H3N），色譜純，購(gòu)自德州潤(rùn)昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;超純水。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1蟲草素腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的配制。參考陳方圓等叫的方法，腺苷、蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品各取10mg（按實(shí)際含量折算），用流動(dòng)相（乙腈：水為5：95）定容至100mL，搖勻。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。參考陳方圓等四的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1蛹蟲草粉前處理。將若千曬干的蛹蟲草子實(shí)體放入粉碎機(jī)中粉碎約1min，粉碎的蛹蟲草子實(shí)體粉末過60目篩子，將樣品混勻后用電子分析天平稱取3份（每份5g）用于后續(xù)加速溶劑萃取法萃取腺苷、蟲草素;分別稱取12份（每份4g）用于后續(xù)水熱回流法、醇熱回流法、超聲波水提法超聲波醇提法提取腺苷和蟲草素。

1.3.2加速溶劑萃取法。前期對(duì)加速溶劑萃取法提取蟲草素腺苷條件進(jìn)行了優(yōu)化，本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上分別挑選最好的處理與4種傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，即提取蟲草素最適處理為溫度100C時(shí)間15min、乙醇含量0%、循環(huán)2次，提取腺苷最適條件為溫度70C時(shí)間10min，乙醇含量20%、循環(huán)2次。

1.3.3傳統(tǒng)方法。一是水熱回流法。將稱取的蛹蟲草粉用雙蒸水定容至100mL，于100C熱回流2h放冷后4000r/min離心10min，過0.22μm濾膜收集濾液。二是醇熱回流法。將稱取的蛹蟲草粉用50%乙醇定容至100mL，于80C熱回流2h放冷后4000r/min離心10min，過0.22μm濾膜收集濾液24-251。三是超聲波水提法。將稱取的蛹蟲草粉用80mL蒸餾水溶解，然后于25C、100Hz超聲波清洗器中超聲3h，定容至100mL，4000r/min離心10min，過0.22μm濾膜收集濾液。四是超聲波醇提法。將稱取的蛹蟲草粉用乙醇與水的混合液（1：1）80mL溶解，然后于25C、100Hz超聲波清洗器中超聲3h，定容至100mL，4000r/min離心10min，過0.22μm濾膜收集濾液。

1.4高效液相色譜（HPLC）

檢測(cè)條件：色譜柱C18（4.6mmx250mm，5μm）;流動(dòng)相乙腈：水=5：95;流速為1.0mL/min;柱溫為35C;進(jìn)樣量為10μL，在波長(zhǎng)260nm紫外檢測(cè)器檢測(cè)。將不同梯度的蟲草素和腺苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，通過標(biāo)樣峰面積制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。將被測(cè)提取液分別進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各處理樣品蟲草素和腺苷含量。相關(guān)公式參考陳方圓等的方法。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究數(shù)據(jù)以平均值為計(jì)算值，數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件（Version11.5，USA）、EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與方差分析（ANOVA）。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算

稱取腺苷、蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，分別配成濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/mL的溶液，各取10μL進(jìn)樣分析。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定線性范圍，得出蟲草素線性回歸方程為Y=32.241X-1.2731，相關(guān)系數(shù)R=0.9999;腺苷線性回歸方程為Y=33.443X-9.0664，相關(guān)系數(shù)R=0.9993。

2.2HPLC色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)品與樣品測(cè)定結(jié)果如圖1所示。圖中峰A為腺苷色譜峰，峰B為蟲草素色譜峰。圖1（a）為50μg/mL蟲草素、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品混合液的色譜圖，從中可以看出，色譜圖中蟲草素腺苷實(shí)現(xiàn)了基線分離，而且出峰時(shí)間也控制得比較好，出峰時(shí)間為A=7.281min、B=9.943min，該流動(dòng)相條件可以用來定量檢測(cè)蟲草素、腺苷的含量。圖1（b）～（f）為5組不同方法的色譜圖，不同處理蟲草素、腺苷出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品相似，加速溶劑萃取法出峰時(shí)間A=7.204min、B=10.098min，水熱回流法出峰時(shí)間A=7.284min、B=10.008min，醇熱回流法出峰時(shí)間A=7.288min、B=10.077min，超聲波水出峰時(shí)間A=7.287min、B=9.958min，超聲波醇提法出峰時(shí)間A=7.271min、B=10.158min，說明該儀器運(yùn)行穩(wěn)定，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

2.3腺苷含量

由表1可知，用5種不同方法提取腺苷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各種方法之間提取的腺苷含量差異達(dá)顯著水平（P<0.05，下同）。其中，加速溶劑萃取法提取效果最好，提取腺苷量為2118.07μg/g;超聲波水提法次之，提取量為1702.40μg/g;腺苷提取效果最差的是超聲波醇提法，提取量?jī)H有180.72μgg。

2.4蟲草素含量

用5種不同方法提取蟲草素，發(fā)現(xiàn)不同方法之間差異均達(dá)到顯著水平，，其中，提取蟲草素效果最好的是加速溶劑萃取法，該方法提取蟲草素的量為19678.70μg/g;超聲波水提法次之，蟲草素提取量為10217.45μg/g;其次是水熱回流法，蟲草素提取量為6018.21μg/g;醇熱回流法次之，提取量為5293.10μg/g;超聲醇提法提取蟲草素效果最差，提取量?jī)H有4108.27μg/g。

3結(jié)論與討論

超聲波水提法、超聲波醇提法、水熱回流法和醇熱回流法是提取腺苷、蟲草素的常用方法，已有不少學(xué)者做過相關(guān)試驗(yàn)，由于原料不同、條件差異等方面的因素，導(dǎo)致得到的結(jié)果也有差異。吳勇等問采用上述方法和滲漉法、微波法共6種方法來提取蟲草素，通過試驗(yàn)以提取量的多少將這幾種方法進(jìn)行排序：滲漉法>微波法>水熱回流法>醇熱回流法>超聲波水法>超聲波醇法。隨后韓建華等29也做了相關(guān)試驗(yàn)，采用超聲波水提法、超聲波醇提法水熱回流法和醇熱回流法提取腺苷和蟲草素，結(jié)果表明，超聲波水提法是最優(yōu)方法，本組試驗(yàn)?zāi)康暮晚n建華等的相同，即比較5種不同提取方法提取腺苷、蟲草素的效果。

加速溶劑速萃取法是近些年新出現(xiàn)的一種新型提取方法，其原理和CO2超臨界萃取儀相似，該方法具有操作流程簡(jiǎn)單、全自動(dòng)、溶劑用量少、時(shí)間短、材料前后期處理簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)叫。目前，不少學(xué)者利用加速溶劑萃取法得到了生物堿、苷類等物質(zhì)。趙恒強(qiáng)等171用此法從黃連中提取黃連素（鹽酸小檗堿）并用正交試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)條件優(yōu)化，確定該方法適合提取黃連內(nèi)的生物堿，最佳提取條件是溫度130C、80%C2H，0H+0.5%HCI作提取溶劑、靜態(tài)提取10min.提取1次;石矛等18得到人參總皂苷，確定最佳工藝參數(shù)為提取溫度140C、提取時(shí)間5min、循環(huán)次數(shù)3次。但目前用此方法提取腺苷、蟲草素的研究很少。前期筆者對(duì)加速溶劑萃取法提取腺苷、蟲草素條件進(jìn)行了優(yōu)化，本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上分別挑選提取腺苷、蟲草素效果最好的處理與其他4種傳統(tǒng)方法進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)與傳統(tǒng)提取腺苷、蟲草素方法相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，它是利用高壓、高溫條件，快速?gòu)挠枷x草中提取出腺苷、蟲草素，并且提高了蟲草素在溶劑中的溶解度和溶出速率。加速溶劑萃取腺苷、蟲草素的研究，為提取腺苷、蟲草素增加了選擇方法。

試驗(yàn)結(jié)果表明，加速溶劑萃取法明顯要優(yōu)于其他傳統(tǒng)4種方法，該方法提取的蟲草素量為19678.70μg/g，超聲波醇提法提取蟲草素效果最差，提取量?jī)H有4108.27μg/g。加速溶劑萃取法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，操作者只需將所有樣品放人儀器一般等待5～20min即可完成萃取。在后期檢測(cè)時(shí)也只需定容、過膜就可直接上HPLC檢測(cè)蟲草素、腺苷的含量綜上所述，加速溶劑萃取法用于提取蛹蟲草中蟲草素及腺苷更為方便快捷。本試驗(yàn)為伊犁乃至新疆地區(qū)蛹蟲草主要活注物質(zhì)提取提供了一定的技術(shù)參考依據(jù)。

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