董蕾

摘要基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的食品溯源和轉(zhuǎn)基因原材料檢測，取決于DNA模板量和品質(zhì)。而在食品加工過程中，溫度、pH值、發(fā)酵、機(jī)械力作用等都會導(dǎo)致原材料DNA降解，為后續(xù)食品溯源、摻偽檢測和轉(zhuǎn)基因原料檢測帶來挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，雖然加工過程會導(dǎo)致DNA降解，但加工食品DNA提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增仍可實現(xiàn)。本文總結(jié)食品加工過程中的溫度、pH值、發(fā)酵、機(jī)械力作用等對DNA的影響，以期為加工食品溯源、摻偽檢測和轉(zhuǎn)基因原料檢測提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 食品加工;DNA降解;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

中圖分類號 TS201.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）05-0212-04

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和大量應(yīng)用，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的食品溯源檢測摻偽檢測和GMO成分分析快速發(fā)展，但食品加工過程中的多種因素會對原材料DNA造成巨大影響，導(dǎo)致DNA一級結(jié)構(gòu)被破壞，使DNA水解、氧化或脫氨基1-2，影響PCR的定性或定量檢測，造成檢測結(jié)果不穩(wěn)定或失敗。同時，加工食品的DNA提取方法也會影響檢測結(jié)果。如何最大限度地獲得加工食品中的原料DNA，去除多糖、多酚、蛋白質(zhì)等對后續(xù)PCR過程的影響或抑制，也成為食品安全分子檢測的重要考慮因素。

本文總結(jié)了近年來國內(nèi)外針對加工食品的DNA提取、檢測及檢測方法，并進(jìn)行簡要分析，以期為我國食品安全檢測、食品溯源和GMO成分分析的進(jìn)一步發(fā)展提供理論參考。

1加工食品DNA提取影響因素

進(jìn)行加工食品檢測的第一步是提取DNA.DNA的品質(zhì)（數(shù)量、純度）決定后續(xù)檢測效果。對于單一原料食品，如豆腐、玉米片等，可以認(rèn)為原料同一，則提取難度降低。但對于復(fù)合原料食品，如餅干、披薩等，原料的復(fù)雜性會導(dǎo)致DNA提取難度上升。在這類食品的處理過程中，就需要確定主要檢測原料，并制訂相應(yīng)提取方案。

一般情況下，加工食品的植物性原材料DNA提取利用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）方法進(jìn)行，該方法具有去除植物性多糖S8和成本低廉的優(yōu)勢910。另外，也有利用磁珠富集的方式進(jìn)行DNA提取，產(chǎn)物直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增"。但由于食品加工過程的許多因素都可以造成DNA降解，導(dǎo)致DNA純度或濃度下降，因而在提取過程中通?？紤]這2個因素的折中方案。表1總結(jié)了前人進(jìn)行食品DNA提取中的優(yōu)化方案，這些方案通過凝膠成像、UV分光光度計、熒光檢測、傳統(tǒng)PCR巢式PCR或RT一PCR等方法進(jìn)行驗證，獲得最優(yōu)結(jié)果。

食品中存在許多化學(xué)成分，這些化學(xué)成分會影響DNA的提取。如各種殺菌劑加工過程中物理性質(zhì)或化學(xué)性質(zhì)的改變，使DNA附著在非溶解性物質(zhì)上，降低DNA的抽提效果21-2）;氧化劑或酶水解縮短DNA長度！P21加工過程中的一些處理，如加熱冷凍等，也會降低DNA片段長度，從而改變DNA提取效率。

2DNA的數(shù)量、純度與PCR的關(guān)系

DNA的數(shù)量：與純度決定PCR擴(kuò)增效率。一般通過檢測DNA片段長度或平均分子量來判斷所提DNA的質(zhì)量，而DNA的質(zhì)量與所檢材料種類、加工過程和DNA提取方法相關(guān)（262）。在轉(zhuǎn)基因食品檢測中，通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段（外源基因片段）分析是否為轉(zhuǎn)基因加工食品。

食品基質(zhì)中存在的大量化學(xué)物質(zhì)對于DNA純度有嚴(yán)重影響。DNA提取過程的選擇和優(yōu)化，可以消除潛在干擾和反應(yīng)抑制物，使基于DNA基礎(chǔ)的檢測技術(shù)獲得成功80-31。首先，原料自身包含的蛋白質(zhì)、多糖、脂類或多酚可能引起DNA污染25.31-32;其次，提取DNA時所用的CTABEDTA、酚類氯仿、SDS、乙醇、異丙醇等，都會干擾Taq酶活性，從而抑制PCR反應(yīng)18.3-31;再次，緩沖液中包含的鹽類、糖類以及其他化合物也會不同程度地降低PCR反應(yīng)效率35-37。因此，在進(jìn)行加工食品PCR擴(kuò)增時，往往需要稀釋DNA提取液，通過降低干擾物的濃度來提高PCR反應(yīng)效率陽通過分光光度計進(jìn)行DNA純度檢測，確定在230、260、280nm處的吸光值，計算A2xo/A280和Azo/A20當(dāng)A20/A280吸收值為1.5～2.0、A206A20超過1.7時，所提取DNA適用于PCR反應(yīng)839。眾多研究發(fā)現(xiàn)，用于PCR的樣品需要DNA的數(shù)量在20～200ng之1間4.31.4042，濃度過高影響反應(yīng)效率明，而過低則容易導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。

加工食品中往往包含多種原材料，并且經(jīng)過多重工序。由于原材料的特性不同，就會影響DNA的提取效率。對于不同食品，往往無法適用一種或幾種通用的提取方法，需要根據(jù)不同材料優(yōu)化不同提取過程。

3目標(biāo)片斷選擇和引物設(shè)計與PCR的關(guān)系

提取DNA是為了進(jìn)行后續(xù)的PCR檢測。普通PCR是使用最普遍的一種分子檢測手段。一般認(rèn)為，普通PCR作為一種定性分析手段，對目標(biāo)片段有很好的擴(kuò)增性。表2總結(jié)了大豆轉(zhuǎn)基因食品PCR評估DNA方法。另外，在小麥146-48]、精煉菜籽油149、馬鈴薯加工23.50-54等加工食品的研究中也常用普通PCR進(jìn)行。

與其他材料的PCR過程相似，加工食品DNA檢測的PCR過程，其引物序列、引物濃度、酶體系大小和程序設(shè)定都會對檢測結(jié)果有重要影響。而由于加工食品的DNA隨著加工步驟的不斷進(jìn)行已經(jīng)出現(xiàn)不同程度的降解，終產(chǎn)品的目標(biāo)片段長度往往僅有100～300bp，因而目標(biāo)片段選擇和弓物設(shè)計至關(guān)重要。

4加工過程對原材料DNA的影響

加工過程種類繁多，溫度、pH值、微生物發(fā)酵等均對食品原材料的DNA有影響，不同材料對于不同的加工過程也會有不同的降解效率，從而影響后續(xù)PCR反應(yīng)1586-9）。因此，了解不同加工過程對不同原料DNA的影響十分關(guān)鍵。

4.1溫度

高溫容易使DNA發(fā)生物理降解，即變性，其作用機(jī)理是高溫引起DNA的脫氨基或脫嘌呤作用。雖然高于100C會導(dǎo)致DNA鏈斷裂，二級結(jié)果被破壞5961，但高溫滅菌或灌制時使用121C進(jìn)行15min處理并不會導(dǎo)致全部DNA破壞。因此，這種加工過程處理后的食品，進(jìn)行DNA有效提取后仍可進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)40但如果再有后續(xù)的烹煮、烘烤、干燥等加熱過程，會5|起DNA的進(jìn)一步降解，而這些過程會導(dǎo)致DNA被切斷成小片段，使PCR效率降低。

4.1.1干熱加工。高溫伴隨干燥過程對DNA影響很大。在薯片制作過程中，70C、2h烘干會導(dǎo)致馬鈴薯DNA降解！21。而溫度越高，DNA的降解速率越快。94C、5min烘烤玉米過程就會導(dǎo)致玉米DNA577bp大小的片段全部消失;同時，研究人員發(fā)現(xiàn)，在玉米片加工過程中1009C烘烤會導(dǎo)致玉米基因組DNA降解7，但大部分經(jīng)過烘烤加工的食品中仍有小分子片段存在，使PCR擴(kuò)增成為可能。

4.1.2濕熱加工。Ogasawara等6對比利用千豆和濕豆制作豆奶制品的過程，同樣是100C60min以上的處理，千豆DNA未出現(xiàn)明顯的改變，而濕豆的830bp和1022bp片段都發(fā)生嚴(yán)重降解。加熱DNA溶液是影響DNA片段最簡便的方法（通過改變時間和溫度）.Hupfer等I62發(fā)現(xiàn)，95C60min后，DNA片段長度損失600bp以上。同樣，Debode等網(wǎng)發(fā)現(xiàn)，在99C7h烹煮后，DNA平均片段仍保持在400bp。微波處理0～15min800W條件下，每次保持最長時間（15min）3次，中間冷卻，會導(dǎo)致DNA嚴(yán)重降解，但DNA片段大小仍大于目標(biāo)片段。

煮沸過程中添加化學(xué)成分也會增加DNA的損失。在玉米粉制作過程中，添加1%石灰粉煮沸20min，這一聯(lián)合效果使DNA片段降解到585bp以下。但后續(xù)沉降蛋白質(zhì)所加人酸和氯化鈣并不會導(dǎo)致DNA進(jìn)一步降解19但在豆腐制作過程中，酸和CaCl的添加并未影響目標(biāo)595bp大片段的擴(kuò)增61。在polenta（一種玉米淀粉制作的粥狀食物）制作過程中，玉米面粉溶解在0.4%氯化鈉溶液中30min煮沸，1914bp片段消失，然而211bp片段在105min加熱后仍可檢測到6。這些結(jié)果均顯示，水煮加熱時間越長，對片段的降解程度越高。

4.1.3油炸。在薯片的加工過程中，植物DNA在175C3min和150C1min下嚴(yán)重降解，只有96bp片段能夠被擴(kuò)增（終產(chǎn)品中）8。然而在油豆腐中，175C對其影響比較小，595bp擴(kuò)然增仍然能陂擴(kuò)增161。另外，對比油炸濕masa和烤干masa，油炸濕masa降解較低，表明水分的存在緩沖了油炸的熱沖擊。

4.2pH值

4.2.1酸性環(huán)境。水果或蔬菜的汁液通常均為酸性環(huán)境，或處理過程中環(huán)境為酸性。如番茄汁，pH值在4.0～4.4之間網(wǎng)。DNA在酸性環(huán)境下，純度下降，同時導(dǎo)致DNA斷裂網(wǎng)。在酸性環(huán)境下，輔以熱處理也會加速酸催化反應(yīng)66.70，BauerT等發(fā)現(xiàn)，在番茄醬制作過程中，pH值為4.3、溫度為65C時會導(dǎo)致DNA快速降解，在面粉發(fā)酵過程中，由于酵母菌發(fā)酵降低面團(tuán)pH值，使小麥DNA出現(xiàn)酸降解現(xiàn)象1-7）。濕磨玉米（酸性環(huán)境下浸泡）比單獨濕磨玉米更容易使DNA降解7。4.2.2堿性環(huán)境。相比酸性環(huán)境，DNA在堿性環(huán)境下穩(wěn)定性較高。pH值為8.5～9.5之間時，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈但并不會斷裂6。在墨西哥卷餅制作的最初階段，需要添加pH值較高的溶液同時加熱，形成pH值為11.0的加熱水溶液，這一過程導(dǎo)致DNA降解。在墨西哥，許多食物（如trilla，玉米片、tacoshells）均需要這種堿性溶液加熱處理。Kharazmi等發(fā)現(xiàn)，585bp片段擴(kuò)增失?。?0），但Hupfer卻發(fā)現(xiàn)，pH值9.0加熱60min，仍能夠檢測到1914bp片段大小DNA。

4.3發(fā)酵

在發(fā)酵過程中，由于微生物以食品原材料為原料進(jìn)行消化代謝，所產(chǎn)生的DNA酶對DNA有強(qiáng)烈降解效果[64]。Pan等叫發(fā)現(xiàn)，miso（日本豆面醬）的制作過程中經(jīng)過120d的發(fā)酵后，35S啟動子無法檢測到。發(fā)酵結(jié)束放置5～6個月的miso中，DNA片段降解到200bp以下67。通過普通PCR和巢式PCR，可以檢測到95bp大小的DNA片段。因此，巢式PCR技術(shù)對于降解成小片段的DNA有更好的擴(kuò)增效果。

4.4機(jī)械力作用

在食品加工過程中，物理作用（如打磨、壓榨）也會使DNA原始片段出現(xiàn)斷裂。尤其在豆類加工制品、各種面粉的制作過程中，打磨是最基礎(chǔ)、最初的步驟，這些物理作用力將DNA降解成小片段，破壞DNA結(jié)構(gòu)。

對預(yù)包裝食品往往進(jìn)行輻照滅菌，以延長其貨架期。輻照射線也會對食品中的DNA產(chǎn)生強(qiáng)烈影響。Villavicencio等叫對豆粕制品施以1000Gy強(qiáng)度的輻照，DNA的破壞程度與輻照強(qiáng)度成正比。

5結(jié)論與展望

食品加工過程中的許多過程都會影響DNA的各級結(jié)構(gòu)。其中高溫和酸度是破壞DNA結(jié)構(gòu)的最主要因素。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，利用各種變異型的PCR技術(shù)（如熒光定量PCR、巢式PCR技術(shù)等），使被降解為小分子的DNA片段檢測成為可能。但為了提高檢測的成功率和靈敏性，目標(biāo)片段的選擇成為關(guān)鍵因素。

由于人們對食品安全的關(guān)注度越來越高，食品摻偽、溯源和GMO檢測成為食品安全檢測的重要發(fā)展方向，利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行原料檢測，使食品安全檢測更加快速、準(zhǔn)確。但由于食品加工過程中的各種過程會對原材料DNA分子造成破壞。因此，了解各種加工過程對DNA的影響，尤其是常見的、重要的加工過程，對于不同食品原料的影響，在產(chǎn)品溯源和GMO檢測時顯得非常關(guān)鍵。

未來，在食品原材料的分子檢測中，最應(yīng)關(guān)注的是小目標(biāo)片段的篩選以及針對不同食品建立特異性強(qiáng)的目標(biāo)片段及對應(yīng)引物體系，檢測確定在加工過程中各食品原材料的更穩(wěn)定基因，同時結(jié)合近年來發(fā)展起來的蛋白組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和核酸適配體等技術(shù)，為食品安全檢測提供更加便捷、準(zhǔn)確的方法革新。

6參考文獻(xiàn)

[1] MEYER R.Development and application of DNA analytical methods for?the detection of GMOs in food[J].Food Control， 1999， 10（6）：319- 399.

[2] KHARAZMI M， BAUER T， HAMMES W P，et al.Effect of food proces -?sing on the fate of DNA with regard to degradation and transformationcapability in Bacillus subilis[J].Syst Appl Microbiol ， 2003 ， 26（4） ：495-501

[3] LIPP M， SHILLITO R ， GIROUX R，et al.Polymerase chain reaction tech-?nology as analytical tool in agricultural biotechnology[J].AOAC Int，2005，88（1）：136-155.

[4] CANKAR K， STEBIH D， DREO T， et al.Critical points of DNA quanti-?fication by real-time PCR- effects of DNA extraction method and samplematrix on quantification of genetically modified organisms[J].BMC Biotech，2006 ， 6：37.

[5] ANKLAM E，GADANI F， HEINZE P，et al.Analytical methods for detec-?tion and determination of genetically modified organisms in agriculturalcrops and plantderived food products[J.Eur Food Res Technol ，2002，214：3- -26.

[6] ISO 21571.Foodstuffs-Methods of analysis for the detection of genetically?modified organisms and derived products-nucleicacid extraction[S].Int-ernational Standard ISO 21571.ISO， Geneva， lstedition， 2005 ，43.

[7] GR YSON N， MESSENS K， DEWETTINCK K.Evaluation and optimisation?of five different extraction methods for soy DNA inchocolate and biscuits.Extraction of DNA as a first step in GMO analysis[J].Sci Food Agric ，2004， 84（11）：1357- 1363.

[8]OLEXOVA L，DOVI 0VI OVA L， KUCHTA T.Comparison of three types?of methods for the isolation of DNA from flours ， biscuits and instantpaps[J].Eur Food Res Technol， 2004 ，218：390- 393.

[9] ZIMMERMAN A， L0THY J， PAULI U.Quantitative and qualitative eval-?uation of nine different extraction methods fornucleic acids on soya beanfood samples[J].Lebensm UntersForsch， 1998 ， 207（2）：81-90.

[10] KAKIHARA Y ，MATSUFUJI H， CHINO M，et al.Extractionand detect-ion of endogenous soybean DNA from fermented foods[J].Food Control，2006， 17（10）：808- -813.

[11] WEIGHARDT F.GMO quantification in processed food?and feed[J].NatBiotechnol ， 2007 ，25：1213- 1214.

[12] LIPP M.IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically?modified soy beans and maize in dried powder[J].Food Composition andAdditives， 1999. 82（4）：923- 928.

[13] DI BERNARDO G， GALDERISI U，CIPOLLARO M ， et al.Methods to i-?mprove the yield and quality from dried and processed figs[J].BiotechnolPro.2005，21：546- -549.

[14] YAMAGUCHI H，SASAKI K， KIDACHI Y ，et al.Detection of recombin-?ant DNA in genetically modified soybeans and tofu[J]Jpn J Food Chem，2000，7：112-116.

[15] GRYSON N，DEW ETTINCK K ， MESSENS K.Influence of cocoacompo -?nents on the PCR detection of soy lecithin[J].Eur Food Res Technol，2007 ，226：247-254.

[16] SMITH DS， MAXWELL PW.Use of quantitative PCR toevaluate several?methods for extracting DNA from corn flourand cornstarch[J].Food Con-trol， 2007， 18：236 -242.

[17] DI BERNARDO G，DEL GAUDIO S，GALDERISI U，et al.Comparative?evaluation of different DNA extraction procedures from food samples[J].Biotechnol Prog 2007 ，23：297-301.

[18] ZIMMERMAN A，L0THY J，PAULI U.Quantitative andqualitative eva-?luation of nine different extraction methods fornucleic acids on soyabean food samples[J].Lebensm UntersForsch， 1998 ， 207（2）：81-90.

[19] CANKAR K，STEBIH D， DREO T，et al.Criticalpoints of DNA quanti-?fication by real-time PCR -effects of DNA extraction method and sam-ple matrix on quantification ofgenetically modified organisms [J].BMCBiot- -ech 2006 ， 6：37.

[20] QUIRASCO M ， SCHOEL B， PLASENCIA J，et al.Suitability of real-ti-?me quantitative polymerase chain reactionand enzyme -linked immuno-sorbent assay for ery9C detection in Mexican corn tortillas： Fate of DNAand protein after alkaline cooking[J].AOAC Int ， 2004，87（3）：639- -646.

[21] BAUER T， HAMMES W P， HAASE N U，et al.ffct of food components?and processing parameters on DNA degradation in food[J].Environ Bio-safety Res， 2004，3：215- -223.

[22] MURRAY S R， BUTLER R C，HARDACRE A K，et al.Use of quanti-?tative real-time PCR to estimate maizeendogenous DNA degradation aftercooking and extrusion or infood products[J].Agric Food Chem 2007，55：223 I -2239.

[23] MEYER R.Development and application of DNA analyticalmethods for?the detection of GMOs in food[J].Food Control， 1999， 10（6）：391-399.[24] BOYCE 0， BURKE G， HENEHAN G.Detecting geneticallymodified fo-ods[J].Food Sci Technol Today， 1998， 12：213-216.

[25] ANKLAM E，GADANI F， HEINZE P，et al.Analytical methods for dete-?ction and determination of genetically modified organisms in agriculturalcrops and plantderived food products[JEur Food Res Technol，2002 ，214： 3- 26.

[26] HEMMER W .Foods derived from genetically modified organisms and?detection methods[Z].Agency for Biosafety Researchand Assessment ofTechnology Impacts of the Swiss PriorityProgramme Biotechnology ofthe Swiss Science Foundation（ BATS）， 1997.

[27] MEYER R， CANDRIAN U.PCR -based DNA analysis for theidenti -?fication and characterization of food components[J].Lebensm Wiss Tec-hnol， 1996，29：1-9.

[28] VAN HOEF AMA， KOK EJ， BOUW E，et al.Development and applica-?tion of a selective detection method forgenetically modified soy and soy-derived products[J].Food AdditContam， 1998， 15 ：767-774.

[29] KUIPER H A.Summary report of the ILSI Europe workshopon detection?methods for novel foods derived from geneticallymodified organisms[J]. Food Control ， 1999， 10：339- 349.

[30] ROSSEN L， NORSKOV P， HOLMSTROM K ， et al.Inhibition of PCR by?components of food samples ， microbialdiagnostic assays and DNA-extraction solutions[J.Int J FoodMicrobiol ，1992， 17：37-45.

[31] TINKER N A， FORTIN M G， MATHER D E.Random amplifiedpolymo-?rphic DNA and pedigree relationships in spring barley[J].Theor ApplGenet， 1993，85：976- 984.

[32] ZIMMERMAN A，LUTHY J，PAULI U.Quantitative andqualitative eva-?luation of nine different extraction methods fornucleic acids on soyabean food samples[J].Lebensm Unters Forsch， 1998 ，207（2）：81-90.

[33] WILSON I G.Inhibition and faciltation of nucleic acidamplification[J].Appl Environ Microbiol， 1997 ，63（ 10）：3741-375110.

[34] HAMMES W P， HERTEL C.Mit Hilfe der Gentechnik erzeugte Lebens-?mittel ： Novel foods und die problematik ihres nachweises [J].Biol Uns-erer Zeit， 1995 ，25：246- -255.

[35] MATSUOKA T， KURIBARA H，et al.A multiplex PCR method of dete- cting recombinant DNAs from five lines ofgenetically modified maize[J].Food Hygienic Soc Japan ，2001 ，42：24 -32.

[36] Joint Research Centre（2005） In：QUERCI M， JERMINI M， VAN DEN- EEDE G（eds） Users manual -Training course on the analysis offood andfeed samples for the presence of genetically modifiedorganisms[J].Ispra，Italy ， 2005.

[37] LIPP M， BRODMANN P， PIETSCH P，et al.IUPAC collaborative trial study of a method to detect geneticallymodified soy beans and maize indried powder[J].AOAC Int， 1992， 82（4）：923- 928.

[38] KNIGHT A.Detecting genetically modified raw materials [J].ManufactConfect ， 2000， 80（5）：51-62.

[39] KAY S，VAN DEN EEDE G.The limits of GMO detection.Nat Biotec -hnol ， 2001 ， 19：405

[40] HUBNER P， WAIBLINGER H U， PIETSCH K，et al.Validation of PCR?methods for quantitation of genetically modified plants in food[J].AOACInt ， 2001 ， 84（6）： 1855-1864.

[41] YOSHIMURA T，KURIBARA H， MATSUOKA T，et al.Applicability of the quantification of genetically modifiedorganisms to foods processedfrom maize and soy[J].Agric Food Chem， 2005 ， 53（6）：2052-2059.

[42] YOSHIMURA T， KURIBARA H， KODAMA T， et al.Comparative stud-?ies of the quantification ofgenetically modified organisms in foods proc-essed from maizeand soya using trial producing[J].Agric Food Chem，2005，53：2060 -2069.