包永睿，王帥，楊欣欣，李天嬌，孟憲生

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，大連 116600)

川芎為傘形科植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根莖，為常用的活血行氣藥，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效[1]，被廣泛用于治療經(jīng)閉痛經(jīng)、頭痛、風(fēng)濕痹痛等。酚酸類成分是川芎中發(fā)揮藥效的一類主要特征成分，具有抗血小板聚集、清除氧自由基、擴(kuò)血管等諸多作用[2-4]。隨著對川芎化學(xué)成分研究的不斷深入，分離純化得到更多、更純的一類藥效物質(zhì)具有廣泛的經(jīng)濟(jì)和社會效益。現(xiàn)有關(guān)于川芎酚酸類成分純化多采用D101、AB-8、DA201、DM301、D140等傳統(tǒng)常用樹脂；隨著科技的不斷發(fā)展，一些專用型、特異性樹脂隨之出現(xiàn)，為某一特定結(jié)構(gòu)的提取純化提供了新方法。本實驗以此為出發(fā)點，采用單因素考察、正交設(shè)計等實驗方法，篩選川芎酚酸類成分最佳提取方法[5]；采用大孔吸附樹脂等技術(shù)，通過靜、動態(tài)吸附與解吸實驗，優(yōu)選川芎酚酸類成分的最佳純化工藝[6-7]。同時通過體外藥效實驗研究酚酸類成分對缺氧神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，為該類成分在臨床的合理應(yīng)用與工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 實驗材料

川芎藥材(購于大連民大中藥有限公司，批號：C140135，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為LigusticumchuanxiongHort.的干燥根)；阿魏酸對照品(購于中國食品藥品檢定研究院，批號：110807-201306)；HPD-600、HPD-400、HPD-300、AB-8、NKA-9、D101、X-5大孔吸附樹脂均購于滄州寶恩有限公司；小牛血清(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y(購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。

2 方法與結(jié)果

2.1川芎酚酸類成分提取工藝優(yōu)選

2.1.1對照品溶液的制備 以阿魏酸為考察指標(biāo)。精密稱取阿魏酸對照品適量，置50 mL量瓶中，加甲醇超聲使溶解，制得每毫升含0.046 6 mg的對照品溶液。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照總酚酸含量測定相關(guān)文獻(xiàn)報道，本實驗擬采用常用三氯化鐵-鐵氰化鉀比色法測定總酚酸含量[8]。精密吸取阿魏酸對照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，分別置25 mL量瓶中，加甲醇至6 mL，加0.3 %十二烷基硫酸鈉2 mL，0.6 %三氯化鐵-0.9 %鐵氰化鉀(1：1)混合液1 mL搖勻，在暗處放置5 min，加入1 mol·L-1的冰醋酸溶液至刻度，搖勻，暗處放置30 min，以顯色劑為空白，740 nm波長處測定吸光度。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，得回歸方程：A=105.69C-0.086 6(r=0.999 9，n=6)。阿魏酸對照品在0.046 6～0.161 0 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3提取因素的考察 通過預(yù)實驗及相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研，以阿魏酸為考察指標(biāo)，選取醇濃度、提取次數(shù)、提取時間、溶劑用量作為影響因素，通過L9(34)正交設(shè)計法進(jìn)行優(yōu)化[9-11]，實驗設(shè)計及結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 川芎酚酸類成分提取工藝正交實驗結(jié)果Tab.1 Results of orthogonal experiment for the extraction process of Chuanxiong phenolic acid

表2 方差分析Tab.2 Variance analysis

F0.05(2，2)=19.00

由此可知，各因素影響程度依次為A>D>B>C，其中 A(乙醇體積分?jǐn)?shù))和D(溶劑用量)對提取結(jié)果有顯著性影響(P<0.05)?？紤]到生產(chǎn)的實際情況，最終確定A因素為90%乙醇是最佳提取溶劑。在正交實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，對D(溶劑用量)因素進(jìn)行細(xì)化分析，在10倍量的基礎(chǔ)上，對6，8，10，12倍量溶劑進(jìn)行單因素考察，結(jié)果總酚酸含量分別為33.26，33.41，32.63，31.81 mg·g-1，可知溶劑用量為8倍量時，總酚酸含量最高，最終確定D因素為8倍量溶劑是最佳溶劑用量。因此，最優(yōu)提取工藝為8倍量90%乙醇回流提取3次，每次2 h。

2.1.4工藝驗證實驗 為合理驗證正交實驗結(jié)果，平行稱取3份等量的藥材，按上述優(yōu)化條件提取，驗證提取工藝的穩(wěn)定性，總酚酸含量分別為33.13，32.22，32.87 mg·g-1，總酚酸平均含量為32.74 mg·g-1，RSD為3.47%，與正交實驗結(jié)果吻合，說明篩選出的提取工藝穩(wěn)定可行，適合于實際生產(chǎn)應(yīng)用。

2.2川芎酚酸類成分純化工藝優(yōu)選

2.2.1靜態(tài)吸附與解吸實驗 精密稱取預(yù)處理好的HPD-600、HPD-400、HPD-300、AB-8、NKA-9、D101、X-5等7種樹脂各1 g，至100 mL具塞錐形瓶中，加入按最佳提取工藝制備的濃度為0.5 g·mL-1樣品溶液10 mL。每10 min振搖20 s，12 h后吸取一定體積上清液，紫外分光光度法測定含量；樹脂抽濾至干，邊抽濾，邊用水100 mL洗滌樹脂，90%乙醇20 mL解吸，4 h后吸取一定體積解吸液，紫外分光光度法測定含量。飽和吸附量(mg·g-1干樹脂)=[吸附前溶液濃度(mg·mL-1)-吸附后溶液濃度(mg·mL-1)]/干樹脂量(g)×吸附液體積(mL)；解吸率(%)=(解吸液濃度×解吸液體積)/(樹脂飽和吸附量)×100%。結(jié)果見表3。

表3 各大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸實驗結(jié)果 Tab.3 Test results of static adsorption and desorption of various macroporous resin

通過靜態(tài)吸附實驗分析，綜合各樹脂總酚酸的飽和吸附量以及解吸率結(jié)果后，HPD-300型樹脂可以得到59.34 mg·g-1總酚酸，優(yōu)于其他型號樹脂，最終確定HPD-300為實驗用樹脂。

2.2.2上樣藥液濃度考察 取預(yù)處理好的HPD-300樹脂10 mL4份，濕法上柱，將0.1 g·mL-1川芎提取液150 mL、0.2 g·mL-1川芎提取液75 mL、0.5 g·mL-1川芎提取液30 mL、0.8 g·mL-1川芎提取液20 mL，以每小時2倍體積(bed volume，BV)的流速上樣，用90 %乙醇各5 BV以2 BV·h-1流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定總酚酸的含量。各洗脫液中總酚酸含量分別為243.81，320.48，272.05，232.15 mg確定上樣藥液濃度為0.2 g·mL-1。

2.2.3泄露曲線考察 取預(yù)處理好的HPD-300樹脂10 g，濕法上柱，將0.2 g·mL-1川芎提取溶液以流速2 BV·h-1上樣，每10 mL收集一次流出液，測定總酚酸的含量。結(jié)果總酚酸在上樣量為60 mL時出現(xiàn)明顯泄露。綜合考慮，上樣量宜為50 mL，即每克樹脂的生藥材用量為1 g。結(jié)果見圖1。

圖1 泄露曲線考察Fig.1 Leaking curve

2.2.4上樣pH值考察 取預(yù)處理好的HPD-300樹脂10 g各5份，濕法上柱，取0.2 g·mL-1川芎提取液50 mL，分別用稀鹽酸、0.4%氫氧化鈉(NaOH)溶液調(diào)pH值至2，3，4，7，8，以2 BV·h-1的流速上樣，用90%乙醇各5 BV以2 BV·h-1流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定總酚酸的含量。結(jié)果上樣pH值為4時，總酚酸的解吸量最大，故確定pH值=4為最佳上樣pH值。結(jié)果見圖2。

圖2 上樣pH值考察Fig.2 Investigation on pH value of samples

2.2.5洗脫醇濃度考察 取預(yù)處理好的HPD-300樹脂10 g各5份，濕法上柱，取0.2 g·mL-1川芎提取液50 mL，以2 BV·h-1的流速上樣，分別用10%，30%，50%，70%，90%乙醇各5 BV，以2 BV·h-1流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定總酚酸的含量。結(jié)果90%乙醇能將總酚酸有效洗脫，故確定90%乙醇為最佳洗脫溶劑。結(jié)果見圖3。

2.2.6洗脫醇用量考察 取 HPD-300樹脂10 mL，濕法上柱，將0.2 g·mL-1川芎提取液50 mL ，以流速2 BV·h-1上樣，先用1倍量水(10 mL)除雜，再用90%乙醇進(jìn)行洗脫，收集8份洗脫液(每份10 mL)，測定總酚酸的含量，繪制洗脫醇用量曲線。結(jié)果5倍量90%乙醇可將近全部總酚酸洗脫下來。故確定洗脫醇用量為5倍量90%乙醇。結(jié)果見圖4。

圖3 酚酸類成分洗脫醇濃度的考察Fig.3 Investigation on the concentration of elution alcohol of phenolic acid

圖4 酚酸類成分洗脫醇用量的考察Fig.4 Investigation on the dosage of elution alcohol of phenolic acid

2.2.7除雜體積考察 分別考察1，2，3，4，5BV水洗除雜體積，結(jié)果水洗液中總酚酸含量分別為0.10，0.13，0.20，0.24，0.23 mg，水洗除雜體積為2 BV時，酚酸類已有一部分損失，故選擇水洗除雜體積為1 BV。

2.2.8川芎酚酸類成分的二次純化及純化工藝驗證 經(jīng)過大孔吸附樹脂一次純化后總酚酸的純度約為20%，因此采用連續(xù)過樹脂的方法將洗脫液按最佳純化工藝條件進(jìn)行二次純化，平行稱取3份川芎藥材粉末，按最佳提取方法進(jìn)行提取，并按最佳純化工藝進(jìn)行兩次上柱，得到兩次純化產(chǎn)物，計算總酚酸的純度及收率，見表4。由數(shù)據(jù)結(jié)果可知該純化工藝穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，適合工業(yè)生產(chǎn)。分析其純度升高、收率降低較小的原因，其樹脂可能對酚酸成分吸附能力較強(qiáng)，而對其他成分富集較弱，間接證明該樹脂對酚酸專屬性較強(qiáng)。

2.3川芎酚酸類成分對缺氧神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用 取對數(shù)生長期的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y，在含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)條件下，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)約12 h，待細(xì)胞貼壁完全，設(shè)加藥實驗組[加藥物和4.5 mmol·L-1連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)造模劑]、空白對照組(只加細(xì)胞，不加藥物和造模劑)、模型對照組(加造模劑，不加藥物)，每組設(shè)5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，每孔避光加5 mg·mL-1噻唑藍(lán)(MTT)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸凈孔內(nèi)上清液，每孔加入二甲亞砜(DMSO)150 μL，搖床振搖10 min，酶標(biāo)儀492 nm處掃描，測定吸光度值(A值)，計算存活率，細(xì)胞存活率(%)=實驗組A/空白對照組A×100%。見表5。

表4 工藝驗證結(jié)果Tab.4 Results of verification process %

表5 川芎酚酸類成分對缺氧損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用Tab.5 Protection phenolic acid in chuanxiong on hypoxic injury of neurocytes

實驗結(jié)果表明，一次純化組與二次純化組中1 g生藥所含酚酸量分別為28.05，26.38 mg，二者差別不大，但純度提升38%以后，藥效提升了近1倍。

3 討論

川芎為傳統(tǒng)常用中藥，目前國內(nèi)相關(guān)研究多集中在化學(xué)成分、藥理作用、藥動學(xué)和質(zhì)量控制等方面，針對川芎總酚酸研究相對較少，且總酚酸提取純化后純度較低，僅為51.7%。采用專用新型樹脂，在結(jié)構(gòu)、極性方面對分離成分進(jìn)行有針對性的富集，可以在原基礎(chǔ)上大幅度提高川芎總酚酸純度及收率，為增加有效部位新藥研制的瓶頸問題提供新的技術(shù)方案。筆者對川芎總酚酸的提取、純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，考察了醇濃度、提取次數(shù)、提取時間、溶劑用量等提取條件及樹脂類型、上樣藥液濃度、上樣量、上樣pH值、洗脫醇濃度、洗脫醇用量等純化條件，獲得純度接近70%，收率為80%的高純度酚酸類成分。實驗結(jié)果表明，工藝穩(wěn)定可靠，適合工業(yè)生產(chǎn)，可以為川芎工業(yè)生產(chǎn)提供參考。同時，本研究對其不同純度的酚酸類成分進(jìn)行了基于缺氧神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用的體外藥效實驗，結(jié)果表明酚酸類成分隨著純度提高，神經(jīng)保護(hù)作用顯著增強(qiáng)，呈一定時間、劑量與效應(yīng)關(guān)系，表明川芎酚酸為川芎藥材神經(jīng)保護(hù)作用藥效物質(zhì)組分，在后續(xù)開展純化物成分解析實驗的基礎(chǔ)上，為其臨床合理利用及新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。