耿會轉(zhuǎn)，滕婧，劉凱，王敏，張平，盧文婷，周順長，黎烈榮

(1.湖北中醫(yī)藥大學第一臨床學院，武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430061；3.華中科技大學實驗動物中心，武漢 430030)

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級未孕SD雌性大鼠，8周齡，體質(zhì)量(200±10)g，連續(xù)1周做陰道脫落細胞涂片觀察，選擇有正常動情周期者40只納入實驗；SPF級雄性健康性成熟SD大鼠20只，體質(zhì)量(250±10)g，均由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2008-0005，動物合格證號：42000600004150。所有大鼠經(jīng)無菌程序轉(zhuǎn)入華中科技大學實驗動物中心SPF級屏障系統(tǒng)動物實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2010-0057。動物實驗環(huán)境維持相對濕度40%～60%，溫度20～24 ℃，噪聲<60 dB，自由飲用無菌水，進食滅菌全價營養(yǎng)顆粒飼料(湖北萬千佳興實驗動物有限公司提供)。

1.2藥物 解郁育胞方藥物組成：白芍10 g(批號為610101)，當歸10 g(批號為802101)，白術(shù)10 g(批號為710112)，茯苓10 g(批號為1402007)，熟地15 g(批號為609102)，山藥 15 g(批號為711205)，酒萸肉10 g(批號為801109)，醋香附10 g(批號為701112)，玫瑰花10 g(批號為609015)。所有藥物均為精選中藥，執(zhí)行標準：《中華人民共和國藥典》2015年版，由湖北辰美有限公司提供。處方藥材炮制合格后，經(jīng)湖北省中醫(yī)院中藥制劑室按水提法制成200 mL，藥物濃度0.5 g·mL-1，放入4 ℃冰箱保存。醋酸潑尼松片(天津力生制藥公司，批號：1701205)每片5 mg，用200 mL雙蒸水配置使用，藥物濃度0.025 mg·mL-1。

1.3試劑 RORγ免疫組化試劑盒(Bioss公司，批號：Bs-3863R)，F(xiàn)oxp3免疫組化試劑盒(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：22228-1-AP)，無水乙醇(國藥集團，批號：10009218)，APC標記抗鼠白細胞介素(IL)-17(IL-17-APC)流式抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：22016-1-022)，APC標記鼠抗Foxp3(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：22013-1-102)，二甲苯(國藥集團，批號：10023418)，蘇木精(Sigma公司，批號：H9627)，中性樹膠(國藥集團，批號：10004160)等。

1.4儀器 流式細胞儀 (美國 Beckman Coulter)，病理切片機(德國Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機)，切片刀(日本羽毛R35一次性刀片)，載玻片及蓋玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司)顯微鏡(日本 奧林巴斯BX53型生物顯微鏡檢)。

1.5方法

1.5.1建立模型 采用ENNIS等[9]所述方法制作慢性應(yīng)激大鼠模型。接受應(yīng)激處理的大鼠置于獨立房間，連續(xù)接受14 d的不同的應(yīng)激原刺激，包括行動受限(2 h)、噪音(75 dB，1 h)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、夾尾(1 min，每天3次)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、電擊足底(電壓50 mV，每隔50 s刺激1次，每次持續(xù)10 s，共30次)。每日抓鬮隨機選擇2種刺激。刺激14 d后以出現(xiàn)倦怠懶動、進食興趣降低及修飾行為(抓癢、抬舉、舔足等)減少等明顯生物學行為，提示造模成功。

1.5.2給藥方法 參照《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表》(見陳奇主編《中藥藥理實驗方法》1994年版)來折算大鼠每日用藥量。按照臨床有效劑量計算出大鼠每日解郁育胞方用藥9 g·kg-1，轉(zhuǎn)化為混懸藥液18 mL·kg-1，即給藥容積18 mL·kg-1。按照體質(zhì)量分層隨機法將大鼠4組：正常對照組，應(yīng)激組，應(yīng)激+潑尼松組，應(yīng)激+解郁育胞方組，每組10只。除正常對照組外，其余3組大鼠建立慢性應(yīng)激模型。于刺激第15天開始，應(yīng)激+潑尼松組每天9：00給予潑尼松溶液灌胃，給藥劑量為0.45 mg·kg-1，給藥容積為18 mL·kg-1；正常對照組、應(yīng)激組灌服等體積純化水(18 mL·kg-1)；應(yīng)激+解郁育胞方組給予解郁育胞方溶液劑量為9 g·kg-1，給藥容積為18 mL·kg-1。4組大鼠分別于第28天16：00 按照雌：雄=2：1合籠，經(jīng)陰道涂片確認妊娠后第4天停藥，當日16：00 處死大鼠，釆用流式細胞技術(shù)檢測著床窗外周血Thl7、Treg細胞比例及比值；同時采用免疫組化技術(shù)檢測著床窗子宮內(nèi)膜 RORγt、Foxp3的表達。

②免疫組織化學(SP法)檢測各組大鼠著床窗子宮內(nèi)膜 RORγt、Foxp3的表達：取血結(jié)束后處死大鼠，剖取并分離子宮，其中一側(cè)置10%多聚甲醛中固定待檢，子宮組織常規(guī)石蠟包埋、3 μm厚切片，常規(guī)脫蠟、水化，EDTA 組織抗原修復(fù)后，將配置好的修復(fù)液(0.01 mmol·L-1枸櫞酸緩沖液，pH值6.0)置于燒杯中高火煮沸，再將脫蠟水化后的組織切片置于燒杯中的耐高溫塑料切片架上，液面要浸過切片組織，修復(fù)時間10～15 min，用吸水紙擦干玻片組織周圍的液體，用油性筆在組織周圍畫圈，然后滴加稀釋好的一抗(FOXP3抗大鼠多克隆抗體1：10)，加完一抗后于4 ℃濕盒中孵育過夜(15 h)。PBS沖洗切片3次，每次3 min，吸水紙擦干切片后滴加HRP標記的山羊抗兔/小鼠二抗，室溫或37 ℃孵育20 min。加顯色劑：PBS沖洗切片4次，每次3 min，甩去PBS液，吸水紙擦干切片，每張切片滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，陽性信號為棕黃色或棕褐色，時間要控制好，切勿顯色過深，當覺得可以時用自來水沖洗切片終止顯色。再經(jīng)過復(fù)染、脫水、封片，奧林巴斯BX53型生物顯微鏡檢拍照，采集圖像，每張切片選取3張400倍照片做吸光度分析，IPP6.0版軟件對免疫組化照片進行吸光度分析。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠子宮內(nèi)膜Foxp3和RORγt的檢測結(jié)果 見表1及圖1。可知，F(xiàn)oxp3主要表達于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的胞漿和部分基質(zhì)血管內(nèi)皮細胞的胞漿，部分間質(zhì)細胞有弱著色，各組表達強弱不一。4組平均吸光度值分別為：0.028±0.005，0.014±0.007，0.056±0.008，0.025±0.007。與正常對照組比較，應(yīng)激組Foxp3的表達顯著降低(P<0.05)，說明慢性應(yīng)激對大鼠著床期子宮內(nèi)膜Foxp3表達有抑制作用。應(yīng)激+潑尼松組Foxp3的表達與其余3組比較，均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明潑尼松在抑制免疫方面有較好的作用。應(yīng)激+解郁育胞方組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

各組大鼠子宮內(nèi)膜RORγt的表達見圖2及表1?？芍琑ORγt表達主要位于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的胞漿，各組表達強弱不一。4組平均吸光度值分別為：0.026±0.007，0.032±0.005，0.028±0.005，0.029±0.003。與正常對照組比較，應(yīng)激組著床窗期子宮內(nèi)膜RORγt表達顯著增加(P<0.05)，說明慢性應(yīng)激對大鼠的子宮RORγt表達有增強作用。應(yīng)激+解郁育胞方組與正常對照組、應(yīng)激+潑尼松組比較均沒有明顯差異(P>0.05)。

表1 4組大鼠子宮內(nèi)膜Foxp3、RORγt檢測結(jié)果Tab.1 Determination results of Foxp3 and RORγt in the endometrium of four groups of rats

與正常對照組比較，*1P<0.05；與應(yīng)激組比較，*2P<0.05。
Compared with normal control group，*1P<0.05;compared with stress group，*2P<0.05.

圖1 4組大鼠子宮內(nèi)膜Foxp3的表達Fig.1 Foxp3 expression in the endometrium of four groups of rats

圖2 4組大鼠子宮內(nèi)膜RORγt的表達Fig.2 RORγt expression in the endometrium of four groups of rats

2.2外周血Th17、Treg亞群比例及比值比較 見表2。正常對照組與應(yīng)激組Th17亞群細胞比例有明顯差異(P<0.05)；與應(yīng)激組比較，其余3組Th17亞群細胞比例均明顯降低(P<0.05)，應(yīng)激+解郁育胞方組與正常對照組、應(yīng)激+潑尼松組Th17亞群細胞比例無明顯差異(P>0.05)。Treg亞群細胞比例比較：正常對照組與應(yīng)激組有明顯差異(P<0.05)；與應(yīng)激組比較，其余3組Treg亞群亞群細胞比例均明顯升高(P<0.05)，應(yīng)激+解郁育胞方組與正常對照組、應(yīng)激+潑尼松組Treg亞群細胞比例無明顯差異(P>0.05)。Th17/Treg比值方面：正常對照組與應(yīng)激+解郁育胞方組無明顯差異(P>0.05)；與應(yīng)激組比較，其余3組Th17/Treg比值均有明顯差異(P<0.05)；與應(yīng)激+潑尼松組比較，正常對照組、應(yīng)激+解郁育胞方組Th17/Treg比值均有明顯差異(P<0.05)。

表2 4組大鼠 Th17、Treg亞群比例及比值比較Tab.2 Comparison of the proportion and ratio of Th17 and Treg subgroups among four groups of rats

與正常對照組比較，*1P<0.05；與應(yīng)激組比較，*2P<0.05。
Compared with normal control group，*1P<0.05;compared with stress group，*2P<0.05.

2.3相關(guān)性分析 Th17/Treg比值與RORγt表達呈正相關(guān)(r=0.608，P<0.05)，Th17/Treg比值和Foxp3的表達呈負相關(guān)(r=-0.389，P<0.05)。

3 討論

醋酸潑尼松具有抗炎、抗過敏、免疫抑制作用，可減輕和防止組織對炎癥的反應(yīng)，從而減輕炎癥的表現(xiàn)；抑制炎癥細胞，包括巨噬細胞和白細胞在炎癥部位的集聚，并抑制吞噬作用、溶酶體酶的釋放以及炎癥化學中介物的合成和釋放，防止和減輕組織對炎癥的反應(yīng)，減輕炎癥表現(xiàn)；防止或抑制細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)及延遲性的變態(tài)反應(yīng)，減少T淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞的數(shù)目，降低免疫球蛋白與細胞表面受體的結(jié)合能力，并抑制IL的合成與釋放，從而降低T淋巴細胞向淋巴母細胞轉(zhuǎn)化，并減輕原發(fā)免疫反應(yīng)的擴展。臨床上常用醋酸潑尼松減輕母胎界面的炎癥反應(yīng)，在本研究中用作陽性對照藥物。但妊娠期婦女使用潑尼松可增加胎盤功能不全、新生兒體質(zhì)量減少或死胎的發(fā)生率，動物實驗有致畸作用，應(yīng)權(quán)衡利弊使用。

對于情志活動異常的心理應(yīng)激反應(yīng)所引起的神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫功能失調(diào)，調(diào)肝是治療的基礎(chǔ)方法。中醫(yī)各臟均在心理應(yīng)激調(diào)節(jié)中起著作用，但核心在于肝臟。心理應(yīng)激的物質(zhì)基礎(chǔ)是NIM網(wǎng)絡(luò)，而中醫(yī)肝的疏泄是維持促進全身氣血運行，調(diào)適臟腑對應(yīng)激的反應(yīng)，存在著一定的NIM網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機制。解郁育胞方是黎烈榮教授以《傅青主女科·嫉妒不孕》開郁種玉湯及《太平惠民和劑局方》逍遙散化裁，是課題組經(jīng)臨床和實驗研究多年的驗方，由當歸、白芍、香附、玫瑰花、白術(shù)、茯苓等組成，稟疏肝養(yǎng)肝、健脾益精為大法。香附、玫瑰花專于理氣，疏肝解郁為君藥。香附氣平而不寒，專屬開郁散氣、順肝之性，助肝之用。凡情志抑郁，肝失疏泄條達，氣不能正常入于三焦，以致氣結(jié)為病者，香附為必用品。玫瑰花柔肝醒脾，流氣和血，和而不猛，宣通郁滯，而絕無辛溫剛燥之弊，是柔肝和血之佳品。當歸、白芍為肝經(jīng)要藥，當歸補血，其氣輕而辛，為血中之氣藥，入肝經(jīng)而行血，疏達肝之氣血；白芍斂肝柔肝，補斂肝之陰血，如是一補一行，一動一靜，既養(yǎng)肝體又助肝用。君臣相伍，疏肝養(yǎng)肝，改善由于高強度、長時間的應(yīng)激造成的機體內(nèi)環(huán)境紊亂及免疫失調(diào)。肝郁不能疏泄水谷且又克脾土，使脾運化水谷功能失調(diào)，水濕不能運化從而出現(xiàn)“滲瀉中滿之證”，導(dǎo)致“腰臍之氣不利”，任帶失調(diào)，胎孕不受。白術(shù)苦甘溫，歸脾胃經(jīng)，茯苓健脾滲濕，二者相伍補土實脾，通達任帶。熟地、山藥、山萸肉取六味地黃丸中三補，益腎填精，共為佐使。腎主生殖，脾為氣血運化之源，脾腎兩虛，與現(xiàn)代醫(yī)學免疫紊亂相似。諸藥配合，解肝郁，養(yǎng)肝血，健脾氣，填腎精，疏中有養(yǎng)，補中寓通，行氣而不傷正，養(yǎng)精而不滯血，使氣血調(diào)和，任通沖盛，胞宮受物而易于孕育。

本研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激大鼠著床期外周血Th17/Treg升高，子宮內(nèi)膜表達Foxp3降低，RORγt水平升高，采用解郁育胞方肝郁后Th17/Treg下降至接近正常水平，著床窗期子宮內(nèi)膜Foxp3表達明顯升高，RORγt表達下降。解郁育胞方提高慢性應(yīng)激大鼠子宮內(nèi)膜容受性的可能機制為通過疏肝健脾益腎，使肝腎開合有度，藏瀉有衡，任通沖盛，胞宮得養(yǎng)；脾氣健運，氣血生化有源。肝之疏泄，脾腎調(diào)補，共同作用于胞宮，調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)，降低應(yīng)激對機體的損傷，增加機體抗應(yīng)激能力，使Th17/Treg失衡得到糾正，共同維護母胎界面的免疫水平。解郁育胞方是一個既能改善胚胎著床又沒有胚胎毒性的中藥復(fù)方制劑，本研究對于臨床助孕技術(shù)的心理應(yīng)激輔助治療，從疏肝養(yǎng)肝的角度，改善子宮內(nèi)膜容受性，提高對母胎界面的免疫保護作用，有利于胎兒在宮內(nèi)生長發(fā)育而不被排斥，提高臨床妊娠率，療效與使用潑尼松無明顯差異，卻規(guī)避了致畸等副作用。