胡玉霞，常福厚，3，王敏杰，4，李君，王躍武，白圖雅，3，呂曉麗，3，肖云峰，劉靜

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心，呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)新藥篩選工程研究中心，呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，呼和浩特 010110；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，呼和浩特 010110)

山楂(Hawthorn)為薔薇科植物山里紅(CrataeguspinnatifidaBge var major N.E.Br)或山楂(CrataegusPinnatifidaBge)的干燥成熟果實(shí)，秋季果實(shí)成熟時采收，切片，干燥[1]。山楂又名紅果、棠棣、綠梨、北山楂，氣微清香，味酸、微甜，具有消食健胃、行氣散瘀的功效[2]。常用于肉食積滯、胃脘脹滿、瀉痢腹痛、淤血經(jīng)閉、產(chǎn)后淤阻、心腹刺痛、疝氣疼痛、惡露不盡、高脂血癥等治療[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山楂中含有150 多種有效成分，主要包括主黃酮類、維生素類、有機(jī)酸類、黃烷及其聚合物類、三萜類和甾體類等[4]。山楂具有調(diào)血脂[5]、強(qiáng)心[6]、降血糖[7]、軟化血管及降血壓[8]、保肝[9]、抗動脈粥樣硬化[10]、抗菌[11]、抗腫瘤[12]、抗氧化[13]、調(diào)節(jié)免疫[14]等作用。山楂為食藥二用植物，具有資源豐富、分布廣泛、價廉易得等特點(diǎn)，值得推廣應(yīng)用。

目前對于山楂的研究主要集中在山楂的化學(xué)成分及藥理作用，對于山楂的安全性研究筆者尚未見報道。因此本課題主要研究目的為評價山楂的安全性，通過觀察山楂細(xì)粉混懸液對清醒Beagle犬心血管系統(tǒng)的影響來初步判定山楂對心血管系統(tǒng)的安全性，為臨床應(yīng)用提供藥理毒理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥材及試劑 山楂(東營百佳益中藥飲片有限公司，批號：20170219)，產(chǎn)地：山東省濰坊市，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生藥教研室渠弼老師鑒定為正品。0.5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號：20170618)；異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司，批號：217171101)；0.9%氯化鈉溶液(山東華魯制藥有限公司，批號：D16070503)。

1.2藥液的配制 CMC-Na溶液的配制：稱取CMC-Na 5 g，多次少量加入至純化水中，邊加熱邊用玻璃棒攪拌使其完全溶解，最后定容至1000 mL，備用。

山楂細(xì)粉的制備：稱取適量山楂飲片，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過孔徑0.15 mm(100目)篩，即得山楂細(xì)粉。

山楂細(xì)粉混懸液的配制：稱取適量山楂細(xì)粉于配藥瓶中，加入約70%總體積的0.5%CMC-Na溶液，先用玻璃棒攪拌溶解后定容至終體積，再用數(shù)控超聲波清洗器100 Hz振蕩10 min，備用。以配制體積1000 mL為例，各給藥劑量組信息見表1。

1.3實(shí)驗(yàn)動物 Beagle 犬6 只，普通級，雌雄各半，體質(zhì)量 9.05～12.15 kg(給予首次劑量時)，購自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0001。Beagle 犬飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心普通設(shè)施內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(蒙)2014-0003(內(nèi)蒙古自治區(qū)科學(xué)技術(shù)廳頒發(fā))。動物飼養(yǎng)間保持12 h 晝夜節(jié)律，溫度控制在20～26 ℃，日溫差≤3 ℃，相對濕度 40% ～70%，換氣次數(shù)≥15次·h-1。動物單籠圈養(yǎng)，每天上、下午定量給食，自由攝取，自由進(jìn)水。動物經(jīng) 2 周的檢疫期后，進(jìn)行遙測系統(tǒng)植入子的植入手術(shù)，在完全恢復(fù)后進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。

表1 山楂細(xì)粉混懸液的配制基本信息Tab.1 Basic information for the preparation of fine powder suspension of hawthorn

1.4實(shí)驗(yàn)儀器與器械 DSI植入式生理信號遙測系統(tǒng)(包括 TL11M3-D70-PCTR植入子、RMC-1 接收器、計算機(jī)采集分析系統(tǒng)、Ponemah 5.0版軟件等，美國Data Sciences International 公司)；動物麻醉機(jī)(VME2，美國Midmark公司)；千分之一分析天平(BSA4202s，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KH-500DV，北京晨曦勇創(chuàng)科技有限公司)；粉碎機(jī)(DS-Y350，上海市頂帥工貿(mào)有限公司)；電子天平(BSA224s，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；手術(shù)刀、手術(shù)剪、手術(shù)鑷、止血鉗、持針器、縫針、縫線、穿引器等均為國產(chǎn)器械。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1植入子植入手術(shù) 根據(jù)DSI公司技術(shù)工程師提供的植入子的埋入方法進(jìn)行植入手術(shù)，主要包括麻醉、植入體主體的放置、壓力導(dǎo)管的植入和心電電極和呼吸電極的植入。麻醉：用異氟烷進(jìn)行呼吸麻醉，手術(shù)過程維持麻醉(麻醉機(jī)標(biāo)示刻度2.5)；植入子主體放置于犬腹中線稍偏左部位；壓力導(dǎo)管埋入腹股溝股動脈里，并預(yù)留 U 型回路以避免因腿部活動而引起導(dǎo)管的牽拉。心電圖(ECG)檢測采用標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)的方式放置，胸右側(cè)2—3肋間隙與鎖骨中線相交處為負(fù)極，胸左側(cè)12—13肋骨體與腋中線相交處為正極。呼吸電極由4條導(dǎo)線組成，正極導(dǎo)線和負(fù)極導(dǎo)線各2條，2條正極導(dǎo)線放置在胸左側(cè)第7肋骨前后，相距2.5 cm，2條負(fù)極導(dǎo)線放置在胸右側(cè)第7肋骨前后，相距2.5 cm，通過檢測呼吸阻抗值，確定呼吸電極放置是否合適。手術(shù)全程通過DSI生理信號遙測系統(tǒng)和VME2型麻醉機(jī)(通過觀察氣囊的變化檢測呼吸頻率)實(shí)時監(jiān)測動物狀態(tài)。動物手術(shù)后進(jìn)入手術(shù)恢復(fù)期，恢復(fù)期為4 周。

1.5.2呼吸校準(zhǔn) 待全部動物恢復(fù)良好后，開始進(jìn)行呼吸校準(zhǔn)。DSI生理信號遙測系統(tǒng)檢測到的呼吸指標(biāo)為呼吸阻抗，通過呼吸校準(zhǔn)將呼吸阻抗轉(zhuǎn)化成呼吸頻率、潮氣量等常用的呼吸指標(biāo)。呼吸校準(zhǔn)操作包括呼吸傳感器的校準(zhǔn)(包括激活Ponemah 通道、校正Pneumotach 的軟件設(shè)置)、用呼吸信號校正阻抗信號(包括軟件設(shè)置、信號采集和校準(zhǔn))。

1.5.3分組及給藥 6 只動物采用拉丁方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計分組。本品山楂臨床成人擬用劑量為9～12 g·d-1，以成人平均體質(zhì)量70 kg計算，最小用藥劑量約為0.12 g·kg-1·d-1。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》以及本中心的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和山楂的最大溶解度，給藥劑量設(shè)計具體如下：實(shí)驗(yàn)分為4 組，分別為溶媒對照組(5‰CMC-Na溶液)和山楂細(xì)粉小、中、大劑量組(0.24，0.72，2.16 g·kg-1)。實(shí)驗(yàn)設(shè)4 個給藥周期，相鄰給藥周期間隔為7 d。

給藥方式：選擇與臨床擬用給藥途徑相近的灌胃給藥，給藥體積為10 mL·kg-1；每個給藥周期內(nèi)固定上午10：30 — 11：30 給藥。給藥劑量與分組設(shè)計詳見表2 和表3。

表2 Beagle 犬灌胃給藥的劑量設(shè)計Tab.2 Oral dosage design of Beagle dogs

表3 Beagle 犬灌胃給予山楂細(xì)粉混懸液的分組設(shè)計(拉丁方設(shè)計)Tab.3 Grouping of Beagle dogs orally treated by fine powder suspension of hawthorn (Latin square design)

N：溶媒對照組；L：山楂細(xì)粉小劑量組；M：山楂細(xì)粉中劑量組；H：山楂細(xì)粉大劑量組。
N：solvent control group；L：low dose hawthorn powder group；M：medium dose hawthorn powder group；H：high dose hawthorn powder group.

1.5.4數(shù)據(jù)采集及記錄 利用DSI公司Ponemah軟件操作平臺(版本5.0)采集動物心電、血壓、體溫等指標(biāo)。心電指標(biāo)包括心率、P-R間期、QRS間期、QT間期、P波、R波、S-T段(取絕對值進(jìn)行統(tǒng)計)、T波，血壓指標(biāo)包括收縮壓、舒張壓、平均壓。采集給藥前2 h及給藥后24 h數(shù)據(jù)。采集間隔為每10 s系統(tǒng)自動記錄一次。0～14 h連續(xù)測定，之后采集給藥后18，24 h時間點(diǎn)數(shù)據(jù)。統(tǒng)計時選取給藥前30 min的時間點(diǎn)為給藥前基礎(chǔ)值、記錄給藥后0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，14，18，24 h。剔除因動物躁動等因素導(dǎo)致的數(shù)據(jù)丟失和大幅度偏移的數(shù)據(jù)，取每個時間點(diǎn)后5 min數(shù)據(jù)的平均值作為該時間點(diǎn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1對清醒Beagle犬心電指標(biāo)的影響 山楂細(xì)粉混懸液對清醒Beagle 犬心電的影響見表4～11。結(jié)果顯示：給藥前各劑量組所有心電指標(biāo)均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與溶媒對照組動物在同一檢測時間點(diǎn)的數(shù)值相比，山楂細(xì)粉小、中劑量組動物所有心電指標(biāo)在所有檢測時間點(diǎn)均未見明顯改變。山楂細(xì)粉混懸液大劑量組動物在給藥后心電指標(biāo)出現(xiàn)如下變化。

心率：在給予大劑量山楂細(xì)粉混懸液6，8 h后，動物心率出現(xiàn)降低(P<0.05)，其中以給藥后8 h的降低幅度最為明顯，與同期溶媒對照組動物心率相比，山楂細(xì)粉混懸液大劑量動物心率降低了24.55%。給藥后10 h，山楂細(xì)粉混懸液大劑量組動物心率恢復(fù)正常。

QT 間期：與溶媒對照組動物在同一檢測時間點(diǎn)的QT值相比，山楂細(xì)粉混懸液大劑量組動物在給藥后6 h，QT間期出現(xiàn)延長(F=12.57，P<0.05)。給藥后8 h，山楂細(xì)粉混懸液大劑量組動物QT間期恢復(fù)正常。

除上述心電指標(biāo)及時間點(diǎn)外，實(shí)驗(yàn)未見其他心電指標(biāo)的改變。

2.2對清醒Beagle犬血壓的影響 山楂細(xì)粉混懸液對清醒Beagle犬血壓的影響見表12～14。結(jié)果顯示：與溶媒對照組動物在同一檢測時間點(diǎn)的數(shù)值相比，各實(shí)驗(yàn)組動物收縮壓、舒張壓和平均壓在所有檢測時間點(diǎn)均未見明顯改變。

表4 4組Beagle犬心率比較Tab.4 Comparison of heart rates among four groups of Beagle dogs 次

與溶媒對照組比較，*1P<0.05。
Compared with solvent control group，*1P<0.05.

表5 4組Beagle犬的P波(絕對值)Tab.5 P waves (absolute value)of four groups of Beagle dogs

表6 4組Beagle犬的P-R間期(絕對值)Tab.6 P-R interval (absolute value)of four groups of Beagle dogs

表7 4組Beagle犬的QRS間期 (絕對值)Tab.7 QRS interval (absolute value)of four groups of Beagle dogs

表8 4組Beagle犬的QT間期 (絕對值)Tab.8 QT interval (absolute value)of four groups of Beagle dogs

與溶媒對照組比較，*1P<0.05。
Compared with solvent control group，*1P<0.05.

表9 4組Beagle犬的R波 (絕對值)Tab.9 R waves (absolute value)of four groups of Beagle dogs

表10 4組Beagle犬的ST段(絕對值)Tab.10 ST segment (absolute value)of four groups of Beagle dogs

表11 4組Beagle犬的T波Tab.11 T waves (absolute value)of four groups of Beagle dogs

表12 4組Beagle犬的收縮壓Tab.12 Systolic blood pressure of four groups of Beagle dogs

2.3對清醒Beagle 犬體溫的影響 山楂細(xì)粉混懸液對清醒Beagle犬體溫的影響見表15。給藥前所有動物體溫均在正常體溫范圍內(nèi)(37.1～38.2 ℃)波動，給藥后，與溶媒對照組動物在同一檢測時間點(diǎn)的數(shù)值相比，不同實(shí)驗(yàn)組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表13 4組Beagle犬的舒張壓Tab.13 Diastolic blood pressure of four groups of Beagle dogs

表14 4組Beagle犬的平均動脈壓Tab.14 Mean arterial pressure of four groups of Beagle dogs

表15 4組Beagle犬的體溫Tab.15 Body temperature of four groups of Beagle dogs

3 討論

安全藥理學(xué)主要是研究藥物在治療范圍內(nèi)或治療范圍以上的劑量時，潛在的對生理功能的不良影響，即觀察藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的影響。根據(jù)需要進(jìn)行追加和(或)補(bǔ)充的安全藥理學(xué)研究[15]。安全藥理學(xué)研究能夠補(bǔ)充毒性實(shí)驗(yàn)觀察的不足，為全面了解藥物的毒性提供基礎(chǔ)，為臨床提供更多的藥理及毒理信息[16]。在藥物的研發(fā)過程中，心血管毒性是導(dǎo)致項目中止的重要因素，即使上市后，仍有許多藥物因?yàn)樾掳l(fā)現(xiàn)的毒性而被迫撤市或限制使用。因此，在新藥研發(fā)階段，安全性藥理學(xué)評價有助于發(fā)現(xiàn)藥物的不良反應(yīng)，預(yù)測不良反應(yīng)發(fā)生的范圍和概率或推測藥物不良反應(yīng)機(jī)制，也有助于發(fā)現(xiàn)藥物的新用途和作用機(jī)制，為藥物研發(fā)的可行性及臨床應(yīng)用提供依據(jù)[17]。

在進(jìn)行心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的安全性評價時，當(dāng)前藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則和ICH S7A 《人用藥物安全藥理學(xué)研究指導(dǎo)原則》均推薦使用清醒動物模型[18]。與傳統(tǒng)的麻醉方式相比，使用清醒動物可有效避免因麻醉藥、動物應(yīng)激導(dǎo)致的動物血壓波動、心率下降和QT間期延長等現(xiàn)象的發(fā)生，能更好地模擬正常動物給藥后在不受束縛情況下的反應(yīng)；另外經(jīng)過藥物洗脫期后動物可重復(fù)給藥，符合動物實(shí)驗(yàn)減少、優(yōu)化、替代的3R原則[19]。

本實(shí)驗(yàn)利用植入式DSI生理信號遙測系統(tǒng)觀察山楂細(xì)粉混懸液對清醒Beagle犬心血管系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明，灌胃給予山楂細(xì)粉混懸液0.24和0.72 g·kg-1(約是臨床擬用藥量的2和6倍)，未觀測到清醒Beagle 犬心電指標(biāo)的明顯變化。與溶媒對照組同期檢測相比，在給予大劑量山楂細(xì)粉混懸液(2.16 g·kg-1，約是臨床擬用藥量的18倍)6，8 h后，動物心率降低(P<0.05)，在給藥后10 h恢復(fù)正常。山楂細(xì)粉混懸液大劑量組動物在給藥后6 h，QT間期出現(xiàn)延長(P<0.05)，在給藥后8 h恢復(fù)正常。各實(shí)驗(yàn)組清醒Beagle 犬的收縮壓、舒張壓和平均壓均未見明顯改變，提示其較大劑量的用藥對循環(huán)系統(tǒng)也較為安全，有利于維護(hù)麻醉期間血液動力學(xué)的穩(wěn)定。各實(shí)驗(yàn)組動物體溫在所有檢測時間點(diǎn)均未見明顯改變，提示山楂不會干擾體溫調(diào)節(jié)中樞，保證了臨床用藥的安全性。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，Beagle 犬灌胃給予小劑量和中劑量山楂細(xì)粉混懸液，所有心血管系統(tǒng)指標(biāo)和體溫均未見明顯改變，因此認(rèn)為山楂在臨床擬用劑量范圍內(nèi)對心電、血壓和體溫?zé)o明顯影響。