翟連鎖，李琳，趙桂芳

（濟南市濟陽區(qū)人民醫(yī)院，山東 濟南 251400）

骨具有強大的修復(fù)、再生功能，在骨折愈合過程中，成骨細(xì)胞主要合成骨基質(zhì)，起著非常重要的作用。TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子具有多種生物學(xué)功能，在骨折愈合中是很強的骨吸收刺激因子，可以促使破骨細(xì)胞分化形成。此外，有大量研究顯示，TNF-α、IL-6會抑制成骨細(xì)胞，進而影響骨折的愈合，但是其確切機制還未研究清楚。串珠素（也叫基底膜蛋白多糖）可影響細(xì)胞和基質(zhì)間的粘附，在軟骨發(fā)育、血管生成中起著非常重要的作用，有研究顯示串珠素還可促進神經(jīng)纖維的修復(fù)。在骨折愈合時，成骨細(xì)胞會表達一定的串珠素，串珠素有利于骨折的愈合[1]。本次研究以期通過研究一定濃度的TNF-α、IL-6對體外培養(yǎng)胎鼠成骨細(xì)胞中串珠素mRNA表達的影響，找出一種抑制成骨細(xì)胞活動的機制，加以干預(yù)，促進骨折愈合的治療。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物：10只新生SD大鼠（24 h）。實驗試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、RT-PCR試劑盒、0.25%胰蛋白酶等。實驗儀器：CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、PCR儀等。

1.2 實驗方法 通過酶消化方法提取胎鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞，并進行傳代培養(yǎng)。在6孔培養(yǎng)板中，以105/mL密度接種傳代培養(yǎng)的第3代成骨細(xì)胞，每孔100 mL細(xì)胞懸液，在37oC下培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為3組（6孔/組）：A組加入等量細(xì)胞培養(yǎng)液；B組加入10 ng/mL TNF-α；C組加入100 ng/mL IL-6。在24 h、48 h、72 h時，收集每孔細(xì)胞，根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書中步驟提取總RNA，使用特異性引物進行RNA的反轉(zhuǎn)錄，最后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并通過Quantity one軟件測定擴增條帶的灰度值，計算灰度比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 通過SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析；計數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

在10 ng/mL TNF-α、100 ng/mL IL-6干擾下，24 h、48 h、72 h胎鼠成骨細(xì)胞串珠素表達量均顯著降低（P＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 對比分析各組細(xì)胞串珠素mRNA灰度比（Mean±SD）

3 討論

機體中有TNF-α、IL-1/6等骨吸收刺激因子，作用靶目標(biāo)為破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞，不僅會影響成骨細(xì)胞的活性，還會促使破骨細(xì)胞活性的增加[2]。所以，如果骨吸收刺激因子的表達過度，會使得喪失骨質(zhì)多于形成的骨質(zhì)，進而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生，大幅度增加了骨折的發(fā)生率；此外，還會使得骨折愈合時間延長，嚴(yán)重的情況下可能會導(dǎo)致骨折不愈合的問題。大量研究顯示，TNF-α、IL-1/6等骨吸收刺激因子可促進破骨前體細(xì)胞的分化，激活NF-kB通路，反作用于TNF-α、IL-1/6，增加其表達量。

目前對骨吸收刺激因子的研究主要集中在破骨細(xì)胞的代謝、分化以及增殖等方面，有關(guān)對成骨細(xì)胞影響的研究比較少。TNF-α可抑制成骨細(xì)胞活性，但是其機制非常復(fù)雜，目前還未研究清除。在人體中，TNF-α受體是一種對抗成骨細(xì)胞強化因子的介質(zhì)，TNF-α?xí)种乒腔|(zhì)合成、成骨細(xì)胞分化，進而抑制骨形成。此外，細(xì)胞凋亡是TNF-α介導(dǎo)抑制的重要通路之一。相關(guān)研究表明，在一定濃度TNF-α作用下，成骨細(xì)胞會發(fā)生凋亡壞死。有研究人員通過大鼠實驗研究了骨折愈合過程中TNF-α的變化情況，結(jié)果顯示骨折部位牽引會影響骨痂的形成，部分骨組織中TNF-α表達量顯著上升，可影響骨折的愈合。有研究人員對吸煙對骨折愈合中TNF-α的表達進行了研究，結(jié)果顯示吸煙會使TNF-α表達量增加，進而使得骨折愈合時間延長。臨床上，有研究人員發(fā)現(xiàn)骨折、手術(shù)創(chuàng)傷會使得患者體內(nèi)TNF-α、IL-6表達顯著增加，并且隨著創(chuàng)傷時間的延長，其表達量慢慢減小。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生中，IL-6因子起著非常重要的作用。上述研究均在一定程度上表明了骨折愈合中，TNF-α、IL-6起著非常重要的作用，然而大部分是以大鼠、小鼠等為實驗對象，在細(xì)胞水平上的研究比較少。

人體中，TNF-α、IL-6是非常重要的炎癥因子，過度表達會造成MODS，也是導(dǎo)致創(chuàng)傷、燒傷等患者死亡的重要因素[3]。臨床上，已經(jīng)開始使用IL-1受體拮抗劑、腫瘤壞死因子單抗等炎癥介質(zhì)類藥物治療SIRS過度反應(yīng)造成的MODS上，但是其實際療效還需要深入研究。在骨折不愈合患者中，TNF-α、IL-6等的表達顯著升高，會影響骨折的愈合。目前，有關(guān)TNF-α、IL-6對骨折愈合的影響主要集中在破骨細(xì)胞方面，對成骨細(xì)胞（特別是分子水平）的研究相對較少。目前，已經(jīng)有研究對串珠素、骨折不愈合間的關(guān)系進行了研究，結(jié)果顯示在骨折愈合中，串珠素起著非常重要的作用，會對骨折愈合產(chǎn)生一定的影響。在骨折愈合中，IL-6、IL-1、TNF-α之間是協(xié)同還是拮抗作用依然需要深入地研究，在臨床上可尋找一條新的道路，找出影響骨折愈合的一種因素，進而為骨折不愈合的治療提供新的治療方法。