■吳宛芹 曲 睿 艾重陽 劉冠聞 師俊玲 蔣春美

(西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西西安710072)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON），又稱嘔吐毒素，是禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的一類真菌毒素，易引起腸道病變，改變腸道屏障[1]，產(chǎn)生免疫毒性[2]，嚴(yán)重威脅著人類和動物的健康。DON 廣泛存在于食品和飼料中[3-5]，尤其是小麥、玉米和燕麥等受鐮刀菌侵染的籽粒中含量較高。DON 具有較強的抗加工和抗加熱能力[6]，難以徹底清除，對食品和農(nóng)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。DON的環(huán)氧基團是其主要的毒性作用位點[7]（圖1），此外，C3 上的羥基在毒性方面也起著重要的作用，均可作為降解DON的作用位點。

圖1 DON結(jié)構(gòu)圖

目前，關(guān)于去除DON 的方法主要有物理、化學(xué)和生物降解法，其中物理和化學(xué)降解方法主要包括紫外線照射[8]、氬等離子體[9]和臭氧處理[10]。臭氧處理雖對小麥和面粉的質(zhì)量沒有負(fù)面影響[11]，但需要特殊的加工設(shè)備且費用昂貴，會對環(huán)境產(chǎn)生不利影響。生物脫毒特異性強、效率高，且是環(huán)境友好型，并可用于不同食品加工階段，具有其他方法不能比擬的優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用[12-13]。生物法主要通過微生物和酶解等方法去除DON。目前已報道許多細菌和酶能降解DON，但這些細菌或酶類能否直接應(yīng)用于飼料及其他谷物等食品加工過程中還有待進一步研究。Doll 等[14]發(fā)現(xiàn)市售降解DON 的產(chǎn)品解毒效果不明顯，因此尋找有效的脫毒產(chǎn)品迫在眉睫。乳酸菌因其益生作用且不會影響產(chǎn)品的質(zhì)量，已成為去除DON的研究熱點。

乳酸菌（Lactobacillus）是食品中常見的益生菌[15]，根據(jù)遺傳學(xué)上的差異，可以分為桿菌、梭菌、柔膜菌[16]。其中桿菌包括6個科，分別是球藻科、肉桿菌科、腸桿菌科、乳桿菌科、明串珠菌科和鏈球菌科[17]。乳酸菌能調(diào)節(jié)全身免疫應(yīng)答[18-19]、抗炎[20]、預(yù)防宮頸癌[15]、緩解腦部疾病[21]、維持腸道微生物菌落平衡[20，22]、改善小鼠便秘[23]和減輕重金屬中毒癥狀[24]，提高機體抵抗力[25]?，F(xiàn)已報道乳酸菌對不同真菌毒素均有去除作用，如去除黃曲霉毒素[26-29]、展青霉素[30]，并能顯著去除DON。

本文主要針對乳酸菌及其他細菌對DON的去除作用進行綜述，通過對其他細菌降解酶的分析，推測乳酸菌降解DON 的可能性及普遍性，展望了在飼料中添加乳酸菌去除DON的應(yīng)用潛力。

1 去除DON的乳酸菌種類

目前已報道的能去除DON 的乳酸菌共有14 種（表1），主要為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbruekii）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、干酪乳酸桿菌（Lactobacillus casei）、乳酸乳桿菌（Lactobacillus lactis）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、黃乳桿菌（Lactobacillus jugurti）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei），它們主要來源于食品和食品原料。其中，以植物乳桿菌、德氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的去除效率較高，為55%左右，其他乳酸菌的DON 去除率較低（13%～40%），這可能是因為不同菌株之間細胞壁成分的差異導(dǎo)致的。

2 乳酸菌去除DON的機制

2.1 生物吸附

微生物去除真菌毒素的方式主要包括生物吸附和酶解作用。目前已有報道的乳酸菌去除真菌毒素的機制多為生物吸附，作用機制為乳酸菌細胞壁上的肽聚糖和胞外多糖結(jié)合真菌毒素，形成可逆的復(fù)合物，從而去除真菌毒素。乳酸菌對DON 的去除方式包括吸附和降解作用，其中以生物吸附作用最為常見（表1）。El-Nezami 等[31]研究了鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG）對DON的去除作用，發(fā)現(xiàn)活菌和滅活的菌株在去除DON 能力上沒有顯著差異，且未發(fā)現(xiàn)新物質(zhì)生成，表明Lactobacillus rhamnosus GG通過吸附作用去除DON。Niderkorn 等[32]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、布氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、黃乳桿菌、乳酸乳桿菌、干酪乳酸桿菌等多株乳酸菌均通過吸附作用去除DON，其中，植物乳桿菌和德氏乳桿菌去除能力最強，去除率高達55%。Franco等[35]利用高效液相色譜法分別對植物乳桿菌、戊糖乳桿菌、類干酪乳桿菌的去除DON能力進行定量分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株均能降低DON 的含量，但未觀察到新物質(zhì)生成。Zou 等[36]研究了乳酸乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳酸桿菌、植物乳桿菌對DON的去除機制，結(jié)果表明，去除方式為物理結(jié)合而非生物轉(zhuǎn)化。Hassan等[37]發(fā)現(xiàn)熱滅活的清酒乳桿菌能夠顯著降低培養(yǎng)基中DON含量。

表1 乳酸菌對DON的去除作用及其DON降解酶

2.2 生物降解

目前已報道的能夠降解DON的微生物主要包括細菌和真菌。生物降解DON主要是通過破壞環(huán)氧基團或改變C3結(jié)構(gòu)，降解產(chǎn)物多為低毒甚至無毒的脫氧化DON（DOM-1）、3-epi-DON、3-酮-DON。一般認(rèn)為，細菌是通過降解酶將DON降解為低毒或者無毒的產(chǎn)物，稱為酶解過程。但也有關(guān)于DON的降解研究，只鑒定出降解產(chǎn)物，并未闡明產(chǎn)生生物降解作用的物質(zhì)（酶或者其他物質(zhì)），其生物降解的機制尚不明晰。

2.2.1 酶解

已報道的具有降解DON能力的酶類共有6種，以醛酮還原酶為主。Karlovsky[38]通過對DON 分子結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測C3位上的差向異構(gòu)反應(yīng)（從DON到3-epi-DON）具有常見性，該反應(yīng)可能需要兩種酶參與，對比DON 及其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)確定該反應(yīng)過程具有不可逆性。Hassan 等[39]證實了這種猜想，通過將合成的3-酮-DON 和DON 分別作為底物與德沃斯氏菌屬（Devosia mutans）反應(yīng)，檢測反應(yīng)產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)從DON 到3-酮-DON 和3-酮-DON 到3-epi-DON 由兩種不同的酶誘導(dǎo)，DON到3-epi-DON 在熱力學(xué)上更容易實現(xiàn)，解釋了該差向異構(gòu)反應(yīng)的不可逆性。3-epi-DON可能通過形成分子內(nèi)氫鍵，破壞環(huán)氧基團，從而使其毒性降低。

由表2 可知，Carere 等從德沃斯氏菌屬（Devosia mutans 17-2-E-8）中分離出兩種能將DON轉(zhuǎn)化為3-epi-DON 的蛋白酶[40-41]，其中，將催化DON 到3-酮-DON的蛋白命名為DepA酶，催化3-酮-DON轉(zhuǎn)化為3-epi-DON 的蛋白命名為DepB 酶（圖2）。DepA 酶是PQQ依賴酶，在不存在PQQ情況下，該酶不能催化DON形成3-酮-DON。對DepB酶結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)該酶屬于醛酮還原酶（AKR家族），具有NADPH依賴性，熱穩(wěn)定性中等，且易于凍干，有較寬的pH作用范圍。

He等[42]從麥田中分離出一株能將DON降解為3-epi-DON 的菌株Sphingomonas S3-4 菌株，并通過基因組序列分析比較，得到了能夠?qū)ON降解為3-酮-DON 的酶AKR18A1，將重組的AKR18A1 蛋白在大腸桿菌中表達，發(fā)現(xiàn)該酶催化DON 的反應(yīng)在一定的溫度和pH 范圍內(nèi)是可逆的，在該酶存在下，加入NADP+，DON 可轉(zhuǎn)化為3-酮-DON，而在NADH 存在下，該酶將3-酮-DON轉(zhuǎn)化為DON。

表2 DON降解酶及其降解產(chǎn)物

圖2 酶降解DON示意圖

除了差向異構(gòu)酶以外，國內(nèi)外的研究學(xué)者還發(fā)現(xiàn)了支持其他反應(yīng)的酶。Ito 等[43]發(fā)現(xiàn)了一種細胞色素P450系統(tǒng)能夠分解代謝DON。研究人員從湖水中分離出一種新菌株KSM1，通過基因組文庫篩選獲得P450基因ddnA，體外重組獲得一個電子傳遞鏈，將該酶系對DON 的作用原理進行表征，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物為16-HDON。通過小麥幼苗測定發(fā)現(xiàn)該氫化作用顯著降低了DON對小麥的毒性。

國內(nèi)研究者也從其他真菌中找到能夠降解DON的酶，楊俊[44]利用和毒素含有相同的環(huán)氧基團的苯基環(huán)氧乙烷，通過環(huán)氧基團類似物對土壤中菌群進行篩選，篩選出一種能夠產(chǎn)生降解苯基環(huán)氧乙烷的菌株黑曲霉F1，從該菌株中提取出一種脂肪酶，并進一步證明該酶能夠降解DON 產(chǎn)生新的物質(zhì)。王開萍[45]利用同樣的方法對土壤中菌群進行篩選，篩選出一株米曲霉As-w6，并對菌株所產(chǎn)生的降解酶進行純化鑒定，發(fā)現(xiàn)該酶屬于脂肪酶，且該酶在40 ℃以下和pH 值6～8 之間具有較好的穩(wěn)定性，能夠降解DON 產(chǎn)生新的物質(zhì)。

目前，尚無明確的研究表明乳酸菌中存在降解DON 的酶類。但Garcia 等[34]發(fā)現(xiàn)在鼠李糖乳桿菌RC007 無細胞上清液能降解DON，且不存在吸附作用。胡杉杉等[33]分離出一株副干酪乳桿菌，在37 ℃、pH值7時去除率最大，研究雖未分析是否存在降解產(chǎn)物，未比較滅活菌和活菌去除DON的差異，但根據(jù)最適反應(yīng)條件推測此副干酪乳桿菌能降解DON?；谝陨蠄蟮揽梢酝茰y，乳酸菌中可能存在降解DON 的機制。

2.2.2 其他生物降解作用

除了上述已知可降解DON 的酶類，也有研究只鑒定了DON 降解后的降解產(chǎn)物，而其產(chǎn)生降解作用的酶類尚未闡明。

Binder等[46]、Binder等[47]和Fuchs[48-49]從瘤胃中分離出能夠脫環(huán)氧化DON的菌株，其降解產(chǎn)物為DOM-1。多個研究在雞腸道和土壤中[50-52]分離出的細菌能將DON 轉(zhuǎn)化為DOM-1[50，53-55]。研究人員通過富集培養(yǎng)從土壤中獲得一株能完全降解DON 的根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizobium），其代謝產(chǎn)物為3-酮-DON，免疫抑制毒性顯著低于DON[56]。Ikunaga等[57]從土壤中分離出第一株能降解并同化DON 的菌株，屬于諾卡氏菌屬（Nocardioides sp.）。德沃斯氏菌屬（Devosia sp.）和Paradevosia shaoguanensis DDB001 通過作用于C3 位點降解DON[39，58-61]，降解產(chǎn)物為3-酮-DON 或3-epi-DON。Ito 等[43]發(fā)現(xiàn)新菌株Sphingomonas sp. Strain KSM1 可將DON 轉(zhuǎn)化為16-HDON。上述降解產(chǎn)物多通過高效液相色譜和氣相色譜進行鑒定，通過產(chǎn)物的保留時間確定產(chǎn)物的種類和結(jié)構(gòu)（表3）。

表3 細菌對DON的降解作用及降解產(chǎn)物檢測條件分析

3 乳酸菌可能存在的降解機制

乳酸菌對DON 的去除機制，除了吸附作用可能存在降解作用，且這種降解作用可能是普遍現(xiàn)象。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)降解DON 的酶類，醛酮還原酶和P450 酶系普遍存在于各種細胞中。但是，目前尚未報道乳酸菌中存在降解DON 的酶類。本文利用Blast 對表2 中6 種降解酶進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)部分乳酸菌中存在與AKR18A1 和DepB 相似的蛋白，分析這兩種酶所誘導(dǎo)的酶促反應(yīng)，推測同時含有這兩種相似蛋白的菌株能將DON 轉(zhuǎn)化為3-epi-DON，首先AKR18A1 誘導(dǎo)DON 轉(zhuǎn)化為3-酮-DON，隨后DepB誘導(dǎo)3-酮-DON 轉(zhuǎn)化為3-epi-DON，完成兩步酶促反應(yīng)。

利用NJ法對具有兩種相似蛋白的菌株構(gòu)建進化樹（圖3），發(fā)現(xiàn)Lactobacillus sp. 2-3、Lactobacillus paralimentarius和Lactobacillus midensis這三種菌株最有可能存在降解DON為3-epi-DON 的能力。分析系統(tǒng)發(fā)育進化樹可知，多株乳酸菌具有降解DON 的能力，除圖3 中所示菌株，鼠李糖乳桿菌已證明能降解DON，說明乳酸菌中可能存在其他降解機制，且乳酸菌可能普遍存在降解DON 的能力。利用在線軟件PredictProtein 對AKR18A1 和DepB 進行分析，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白均存在于細胞質(zhì)中，且可催化DON 到3-epi-DON 的差向異構(gòu)反應(yīng)；同時，只含有AKR18A1相似蛋白的乳酸菌也能將DON 轉(zhuǎn)化為毒性更低的3-酮-DON。

圖3 基于AKR18A1和DepB蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

同時，對目前已經(jīng)檢測出對DON 為生物吸附作用的乳酸菌（表1）進行分析，發(fā)現(xiàn)部分乳酸菌也含有與AKR18A1和DepB相似的蛋白，因此推測這些菌株對DON不僅存在吸附作用，還可能存在降解作用。

4 乳酸菌去除DON的應(yīng)用

已有研究表明可在飼料中添加乳酸菌降低DON毒性，增強腸道抵抗力。Garcia 等[34]利用豬空腸外植體研究鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus RC007）對DON 的去除作用，發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌可有效去除DON，緩解DON引起的腸道毒性，維持腸道健康，可作為飼料添加劑降低DON 引起的腸道毒性。Wu 等[67]和段永樂[68]通過研究植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum JM113）對DON 引起的腸道毒性的保護作用，以肉雞為研究對象，發(fā)現(xiàn)該菌株能減少DON對腸道屏障的損傷，增加有益菌的豐度，增強腸道的消化吸收和代謝功能。在飼料中添加乳酸菌降低DON，可以改善機體調(diào)節(jié)能力，促進代謝消化和養(yǎng)分利用[69]。同時乳酸菌還能降低污染小麥中鐮刀菌毒素，提高小麥發(fā)芽率[70]。

5 展望

目前DON 的去除多采用DON 降解酶，或?qū)⒕曛苯蛹尤腼暳匣蚬任镏?，但目前報道有效的菌株多來源于腸道或土壤中，這些菌株的安全性和有效性還有待評估。添加乳酸菌等益生菌去除DON將是未來發(fā)展的主要方向，能避免影響產(chǎn)品質(zhì)量和對機體造成傷害，促進機體健康生長。

關(guān)于乳酸菌去除DON的機制已報道的多為吸附作用，但吸附作用往往可逆，復(fù)合物的穩(wěn)定性受到很多因素的影響，菌種、處理方式以及環(huán)境因素都能導(dǎo)致復(fù)合物重新釋放毒素，不能永久去除，存在較大風(fēng)險，使得利用乳酸菌降低飼料和食品中DON 受到限制。本文通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)乳酸菌中可能普遍存在降解DON 的機制，且已有報道鼠李糖乳桿菌能降解DON。因此，未來進一步證明乳酸菌降解DON的機制，發(fā)掘乳酸菌中的新型DON降解酶，從而推動DON生物降解的研究及其在飼料及食品行業(yè)的應(yīng)用。