■程 瑛 王 冠 呂夢(mèng)嫻 劉 營(yíng)

（武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司，湖北武漢430074）

2017年漁業(yè)年鑒顯示：全國(guó)水產(chǎn)總量6 445.33萬(wàn)噸，比上年增長(zhǎng)1.03%；在國(guó)內(nèi)漁業(yè)生產(chǎn)中，海水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量為141.94萬(wàn)噸，比上年增加12.70萬(wàn)噸，淡水養(yǎng)殖魚類2 540.98 萬(wàn)噸，比上年增長(zhǎng)0.88 萬(wàn)噸[1]。隨著魚類產(chǎn)量的不斷增長(zhǎng)，我國(guó)魚類加工產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，2017年魚類的加工量達(dá)2 196.25萬(wàn)噸。魚類加工業(yè)的快速發(fā)展，產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物，其中主要包括魚皮，占魚總重量10%左右[2]。魚皮中蛋白含量高，是巨大的潛在可利用蛋白資源，可用來(lái)制備膠原蛋白、明膠等產(chǎn)品，而膠原蛋白在醫(yī)藥、化妝品、保健品等高附加值產(chǎn)品領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的利用，因此，如直接廢棄?mèng)~皮會(huì)造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。

本實(shí)驗(yàn)的目的是能夠合理的利用水產(chǎn)品下腳料，減少資源浪費(fèi)，同時(shí)可以帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)效益，開闊水產(chǎn)品下腳料的市場(chǎng)。我國(guó)是馬哈魚加工和代加工大國(guó)，加工過(guò)程中產(chǎn)生大量廢棄?mèng)~皮。因此，本實(shí)驗(yàn)以海魚皮馬哈魚皮為實(shí)驗(yàn)材料。馬哈魚是名貴冷水魚，其魚皮膠原蛋白或明膠與其他魚類相比有自身特點(diǎn)，更易被吸收利用，被認(rèn)為是開發(fā)膠原蛋白肽等功能產(chǎn)品的良好資源，具有廣闊的市場(chǎng)開發(fā)價(jià)值。國(guó)內(nèi)外利用魚皮提取明膠的研究很多，所用魚皮原料多為鯊魚魚皮[3]、草魚魚皮[4]和單角革鲀魚魚皮[5]等，但是對(duì)馬哈魚魚皮提取明膠或者其他功能型膠原蛋白的研究較少。且國(guó)內(nèi)未見馬哈魚魚皮加工利用的相關(guān)報(bào)道，國(guó)外對(duì)馬哈魚魚皮的加工利用研究也鮮有報(bào)道。

國(guó)內(nèi)外很多的報(bào)道對(duì)魚皮的處理采用強(qiáng)酸堿的方法，此種處理方法不僅對(duì)環(huán)境污染大，并且操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)且危險(xiǎn)，本實(shí)驗(yàn)不采用傳統(tǒng)的酸堿處理方法，直接采用環(huán)保安全的酶解法來(lái)處理馬哈魚魚皮，得到目標(biāo)分子量的小肽，并且減少環(huán)境污染。根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，平均分子量≤500 Da 稱為小肽，平均分子量1 000～3 000 Da稱為多肽，平均分子量3 000～5 000 Da稱為大肽。本實(shí)驗(yàn)希望通過(guò)酶解法能夠得到目標(biāo)分子量的肽，且比較幾種酶解法的可行性。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T 6682 中二級(jí)用水的規(guī)格，使用試劑除特殊規(guī)定外，均為分析純。

1.1 試劑材料

1.1.1 酶制劑

堿性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶均來(lái)源于武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司。海魚皮為馬哈魚皮。

1.1.2 試劑和儀器

硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、濃鹽酸、無(wú)水碳酸鈉、溴甲酚綠-甲基紅指示劑、三氯乙酸（國(guó)藥集團(tuán)），乙腈、三氟乙酸（色譜純），細(xì)胞色素C、抑酞酶、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）等試劑。

THZ-82 恒溫水浴搖床（常州國(guó)華），凱氏定氮儀（Foss），高效液相色譜儀（安捷倫）：配有紫外檢測(cè)器和含有GPC數(shù)據(jù)處理軟件的色譜工作站或積分儀，凝膠色譜柱（賽分科技）。

1.2 方法

1.2.1 海魚皮的酶解反應(yīng)

按照馬哈魚皮與水的質(zhì)量比1∶4的比例配制魚皮水混合液，其中水的pH值提前使用10%的碳酸鈉調(diào)節(jié)至8.0～9.0，記錄反應(yīng)器和魚皮水混合液的總重，在50 ℃恒溫水浴搖床中預(yù)熱5～10 min，按照各添加量加酶制劑，攪拌均勻，繼續(xù)于50 ℃恒溫水浴搖床中酶解2 h，酶解完成之后，沸水浴滅酶10 min，冷卻，定重，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 水解度

凱氏定氮法測(cè)定。

1.2.3 酸溶蛋白

TCA法測(cè)定。

1.2.4 肽分子量檢測(cè)

色譜柱：SRT SEC-150 7.8×300 mm（內(nèi)徑）或性能與此相近的同類型其他適用于測(cè)定蛋白質(zhì)和肽的凝膠柱。流動(dòng)相：乙腈+水+三氟乙酸=19.98+79.92+0.1。檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。流速：0.5 ml/min。檢測(cè)時(shí)間：33 min。進(jìn)樣體積：20 μl。柱溫：25 ℃。

相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別用流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度為1 mg/ml的上述不同相對(duì)分子質(zhì)量肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按一定比例混合后，用孔徑0.2～0.5 μm 有機(jī)相膜過(guò)濾后進(jìn)樣，得到標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)對(duì)保留時(shí)間作圖或作線性回歸得到相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線及其方程。

1.2.5 不同的酶制劑

a 組：堿性蛋白酶：添加量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.30%、0.40%、0.50%、0.60%；

b 組：中性蛋白酶：添加量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.36%、0.48%、0.60%；

c 組：木瓜蛋白酶：添加量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.23%、0.30%、0.46%；

d組：木瓜蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶3：添加量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.50%、0.60%、0.70%、0.80%。

以上四組實(shí)驗(yàn)的添加量設(shè)計(jì)原則為保持四種配方的成本一致。按照上述四組實(shí)驗(yàn)配制實(shí)驗(yàn)用酶制劑，對(duì)馬哈魚皮進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，比較常見指標(biāo)水解度、酸溶蛋白、肽分子量≤1 500 Da 的分布。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組如表1。

2 結(jié)果

2.1 不同添加量的堿性蛋白酶酶解效果

馬哈魚皮通過(guò)不同添加量的堿性蛋白酶酶解之后的各項(xiàng)指標(biāo)見表2，從表2中可看出，添加量逐漸加大，其水解度和酸溶蛋白的變化小，無(wú)法比較出哪個(gè)添加量的酶解效果好，從肽分子量≤1 500 Da分布可看出，堿性蛋白酶的添加量為0.3%時(shí)最差，添加量逐漸增大，目標(biāo)肽分布面積逐漸變大，但趨勢(shì)并不明顯，因此，可以根據(jù)對(duì)分子量的需求來(lái)確定堿性蛋白酶的添加量。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組

表2 不同添加量的堿性蛋白酶的酶解結(jié)果

圖1 中標(biāo)準(zhǔn)品，從10 min 開始出現(xiàn)四個(gè)明顯的峰，依次為細(xì)胞色素C（分子量為12 500 Da）、抑酞酶（分子量為6 500 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（簡(jiǎn)稱四肽，分子量為451 Da）和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（簡(jiǎn)稱三肽，分子量為189 Da）；添加量為0.3%的堿性蛋白酶，在10 min 之前出現(xiàn)一個(gè)峰，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品信息可斷定此峰的化合物分子量在12 500 Da 以上，說(shuō)明此添加量下，存在未被酶解的化合物，因此需加大堿性蛋白酶的添加量。比較另外三個(gè)添加量，從色譜圖可看出，在15～25 min之間，三組添加量的肽分子分布基本重合，差異表現(xiàn)在峰面積有所不同，添加量越大，峰面積越大，但是遞增趨勢(shì)并不明顯。

圖1 不同添加量的堿性蛋白酶酶解之后高效液相色譜圖

從表2 和圖1 可看出，隨著堿性蛋白酶添加量的改變，有明顯變化的是添加量從0.3%到0.4%，分子量≤500 Da的肽分布面積增大，從0.4%開始的添加量各指標(biāo)顯示分子量1 500 Da 以上的肽的分布變化差異不明顯。四組添加量中水解度、酸溶蛋白這兩項(xiàng)指標(biāo)并無(wú)明顯差異。

2.2 不同添加量的中性蛋白酶酶解效果

馬哈魚皮通過(guò)不同添加量中性蛋白酶酶解之后的各指標(biāo)見表3，從表3 可看出，添加量逐漸增大，其水解度和酸溶蛋白的變化差異小，而酶解之后肽分子量≤1 500 Da的分布比例增大。

圖2中標(biāo)準(zhǔn)品分析同圖1分析。從色譜圖中可看出，三種添加量的中性蛋白酶出現(xiàn)的峰基本重疊，差異在于峰高不同，依次為0.60%的中性蛋白酶＞0.48%的中性蛋白酶＞0.36%的中性蛋白酶，因此，從色譜圖來(lái)看，添加量越高，出現(xiàn)重疊部分的峰面積越大，說(shuō)明添加量增大，各目標(biāo)肽的含量在增加。

從表3 和圖2 可以看出，目標(biāo)肽的分布面積在緩慢增大，但并不明顯，當(dāng)中性蛋白酶的添加量到0.60%，分子量≤5 000 Da的肽的分布面積達(dá)到90%左右，說(shuō)明中性蛋白酶添加量到一定的量時(shí)，完全可以都酶解為分子量為5 000 Da的肽。

表3 不同添加量的中性蛋白酶的酶解結(jié)果

圖2 不同添加量的中性蛋白酶酶解之后高效液相色譜圖

2.3 不同添加量的木瓜蛋白酶酶解效果

馬哈魚皮通過(guò)不同添加量的木瓜蛋白酶酶解之后的各項(xiàng)指標(biāo)見表4，從表4 中的各指標(biāo)可以看出，隨著添加量的增大，酸溶蛋白幾乎無(wú)變化，水解度先增加后降低，而肽分子量基本上都在1 000 Da以下，說(shuō)明木瓜蛋白酶的效果很好，如果目標(biāo)肽分子量需求是1 000 Da 以下，可以選取合適添加量的木瓜蛋白酶。

表4 不同添加量的木瓜蛋白酶的酶解結(jié)果

表4中木瓜蛋白酶的添加量在增加，分子量300 Da以下的有差異，有下降的趨勢(shì)，而分子量1 000 Da 以下的差異不明顯。

圖3中標(biāo)準(zhǔn)品分析同圖1分析。從色譜圖上可看出，三種添加量的木瓜蛋白酶出現(xiàn)的峰基本重疊，最高峰值的保留時(shí)間離四肽較近，并且三組不同的添加量下，僅出現(xiàn)一組比較明顯的峰，可見，經(jīng)過(guò)木瓜蛋白酶酶解之后的肽基本集中在一起，并且三種不同的添加量的木瓜蛋白酶的出峰的峰高也基本重合，說(shuō)明木瓜蛋白酶的添加量可以更少。

從表4 和圖3 可以看出，木瓜蛋白酶的作用效果很明顯，酶解之后的肽分子量大多≤1 000 Da，根據(jù)下游產(chǎn)品的需求，如果希望魚皮酶解之后多為≤1 000 Da，可選擇采用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解。

圖3 不同添加量的木瓜蛋白酶酶解之后高效液相色譜圖

2.4 不同添加量的復(fù)合酶制劑（木瓜蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶3）酶解效果

馬哈魚皮通過(guò)不同添加量的復(fù)合酶制劑酶解之后的各項(xiàng)指標(biāo)見表5，從表5中各指標(biāo)可以看出，復(fù)合酶制劑添加量為0.8%時(shí)，水解度最高，酸溶蛋白最高，但是分子量≤1 000 Da的肽分布面積反而降低，而添加量為0.7%的分子量≤1 000 Da的肽分布比例最高；其次，復(fù)合酶制劑添加量增加，分子量≤300 Da的肽分布比例增加，當(dāng)添加量到0.80%時(shí)，出現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明復(fù)合酶的使用不能提高小肽含量，可以明顯提高多肽的含量。

表5 不同添加量的復(fù)合酶制劑的酶解結(jié)果

圖4中標(biāo)準(zhǔn)品分析同圖1分析。從圖4上可以看出，除了添加量為0.80%復(fù)合酶制劑的峰高比較高，其他三條基本重合，說(shuō)明0.5%、0.6%、0.7%三個(gè)梯度，隨添加量增加，并不明顯增加≤3 000 Da肽的含量。

3 討論

3.1 不同添加量的堿性蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)馬哈魚皮的酶解

堿性蛋白酶和中性蛋白酶均是一種內(nèi)切酶，多屬于絲氨酸蛋白酶，絲氨酸蛋白酶催化底物蛋白質(zhì)水解時(shí)通常有兩個(gè)步驟：在水解過(guò)程中，隨著氨基酸的丟失和肽鏈的斷裂還形成共價(jià)酶-肽復(fù)合的中間二聚體；然后脫去?；?，通過(guò)水對(duì)中間體的親核攻擊，從而使底物肽鍵水解。堿性蛋白酶的酶切位點(diǎn)主要斷裂疏水氨基酸的C 末端，可特異性切割谷氨酰胺-組氨酸、絲氨酸-組氨酸、亮氨酸-酪氨酸、酪氨酸-蘇氨酸之間的肽鍵[6]。而中性蛋白酶對(duì)酶切位點(diǎn)無(wú)特異性。兩種酶的作用效果來(lái)看，中性蛋白酶的水解度稍差。從分子量的分布情況來(lái)看，兩者的小肽含量分布面積較高，肽分子量≤5 000 Da 的分布情況在成本一致的情況下，隨著添加量的增大基本趨于一致。由于酶解馬哈魚皮之后需制作的產(chǎn)品的要求各不相同，因此，可以根據(jù)產(chǎn)品需求選擇相應(yīng)的配方。

3.2 不同添加量的木瓜蛋白酶對(duì)馬哈魚皮的酶解

木瓜蛋白酶是一種內(nèi)切酶，屬于巰基蛋白酶，可水解絕大多數(shù)肽鍵，但對(duì)不同肽鍵水解的速率相差較大，該酶對(duì)蛋白質(zhì)或多肽中精氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸的羧基形成的肽鍵非常敏感[7-10]。它的作用機(jī)制為：在His-159作用下Cys-25去質(zhì)子化，而Asn-158能夠幫助His-159的咪唑環(huán)的擺放，使得去質(zhì)子化可以發(fā)生，然后Cys-25親核攻擊主鏈上的羧基端，并與之共價(jià)鏈接形成?；?酶中間體，接著酶與一個(gè)水分子作用，發(fā)生去酰基化，并釋放肽鏈的羧基末端，他的酶切位點(diǎn)具有廣泛特異性，主要包括Arg-、Lys-、Phe-X-。木瓜蛋白酶屬于動(dòng)物性水解蛋白酶，從酶解之后的水解度來(lái)看，添加量變大，水解度出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但是小肽含量的分布情況變化不大，集中在300～1 000 Da，如果產(chǎn)品對(duì)小肽要求含量比較高，木瓜蛋白酶是個(gè)很好的選擇。

圖4 不同添加量的復(fù)合酶制劑酶解之后高效液相色譜圖

3.3 不同添加量的復(fù)合酶制劑對(duì)馬哈魚皮的酶解

復(fù)合酶制劑包括木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶，這兩種酶均屬于內(nèi)切酶，但是兩種酶均有各自專屬的肽鍵切割位點(diǎn)，其水解活力均較高，因此可將這兩種酶組合使用。組合使用之后水解度均達(dá)到80%以上，小肽含量隨著添加量的增加先增大后減小，分子量3 000 Da以下肽的變化差異小?？筛鶕?jù)產(chǎn)品需求選擇合適的添加量配方。

4 結(jié)論

①本實(shí)驗(yàn)選取的四組酶制劑配方，其水解度都達(dá)到80%以上，堿性蛋白酶效果更佳；酸溶蛋白的含量均在2.0%左右，差異不明顯。

②從整體的分子量分布來(lái)看，木瓜蛋白酶的效果最好，酶解之后基本都是小肽，其次是堿性蛋白酶，其次是中性蛋白酶，復(fù)合酶制劑效果最差。