蘭世捷 陳 亮 苗 艷馮萬(wàn)宇 王志強(qiáng) 朱慶賀 金振華 李 陽(yáng) 徐 馨 李 丹

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005）

豬繁殖障礙性疾病是危害養(yǎng)豬場(chǎng)尤其是種豬場(chǎng)最為嚴(yán)重的疾病之一，妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)，初生仔豬免疫力差，往往出現(xiàn)弱胎、死胎和木乃伊胎，也有的母豬發(fā)生隱性感染不表現(xiàn)任何臨床癥狀[1]。由于母豬的繁殖障礙類疾病隱蔽性強(qiáng)，可發(fā)于妊娠期的任何時(shí)間，發(fā)病豬既能通過(guò)環(huán)境將其傳給其他健康豬，也可通過(guò)胎盤(pán)將病毒垂直傳給胎兒，導(dǎo)致健康豬和新生仔豬發(fā)生該類疾病[2]。繁殖障礙類疾病中以豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）常見(jiàn)[1]，發(fā)生這3種疾病的臨床癥狀極為相似。近年來(lái)，母豬繁殖疾病以多個(gè)病毒混合感染較常見(jiàn)，單純依據(jù)臨床癥狀很難做出確切診斷，傳統(tǒng)的血清學(xué)、免疫學(xué)診斷方法存在操作繁瑣、周期長(zhǎng)、敏感度差以及檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，無(wú)法滿足目前實(shí)驗(yàn)室和臨床大批量檢測(cè)[3]。

多重PCR（multiplex PCR，mPCR），也稱為多重引物PCR或者復(fù)合PCR，它是在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入2對(duì)或2對(duì)以上引物，從而同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)基因片段的PCR反應(yīng)，也是近些年人類醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和動(dòng)物醫(yī)學(xué)常用的一種分子生物學(xué)檢測(cè)手段。mPCR法具有檢測(cè)靈敏性高、時(shí)間短、節(jié)省材料、節(jié)約經(jīng)費(fèi)等優(yōu)勢(shì)，可通過(guò)一次反應(yīng)檢測(cè)出多個(gè)病原，更適合于多種病原混合感染的精確快速診斷[4]?；讷F醫(yī)科研和臨床的需要，且為豬病檢測(cè)提供一種新的手段，本研究利用多重PCR法建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)豬CSFV、PRRSV和PCV2等病毒的新方法。實(shí)驗(yàn)室及臨床試驗(yàn)表明，該方法操作簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確性高、時(shí)間短，可以一次檢測(cè)3種病毒，做到確切診斷，為豬繁殖障礙性疾病診斷提供新的手段[5]，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和陽(yáng)性對(duì)照

豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型的陽(yáng)性毒株均購(gòu)自上海海利生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 樣品來(lái)源

豬的病料樣品采集于2016—2018年間黑龍江省齊齊哈爾市周邊縣區(qū)及臨近內(nèi)蒙古自治區(qū)部分豬場(chǎng)，采集臨床表現(xiàn)疑似繁殖障礙疾病的母豬內(nèi)臟、淋巴結(jié)活體組織。每頭豬的各組織混合成1份病料。

1.1.3 主要試劑

Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；dNTP、Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000、5×RT Buffer及M-MLV酶和RNA酶抑制劑購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖購(gòu)于Biowest公司；DNA及RNA提取試劑盒購(gòu)于北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中PRRSV、CSFV 和PCV2的標(biāo)準(zhǔn)參考毒株基因組序列選擇保守基因，分別選擇PRRSV的ORF7基因、CSFV的E2基因和PCV2的ORF2基因做為擴(kuò)增靶序列，應(yīng)用Primer 5.0和Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用ddH2O稀釋，－20℃保存?zhèn)溆?，?jiàn)表1。

表1 多重RT-PCR引物設(shè)計(jì)結(jié)果

1.2.2 DNA和RNA的提取

取疑似病豬的心、肺、脾和淋巴結(jié)組織，分別剪取每個(gè)組織不同位置的樣品放在研磨器中研磨，同時(shí)加入適量的生理鹽水勻漿后，置于－20℃反復(fù)凍融3次，8 000 rpm/min離心3 min，取上清液于1.5 mL滅菌離心管中，分別按照北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)的DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將提取好的DNA/RNA檢測(cè)合格后，置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RNA病毒模板的制備

取提取好的PRRSV和CSFV的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為20 μL，其中RNA模板 6 μL、random primers 1 μL、2.5 mM dNTP 4 μL、ddH2O 1 μL、65℃ 5 min，冰浴 30 s；buffer 4 μL、0.1 M DTT 2 μL、酶抑制劑 1 μL、37℃ 2 min；MLV 1μL、25℃ 10 min、37℃ 1.5 h、70℃ 13 min。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA檢測(cè)合格后，置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 單項(xiàng)PCR檢測(cè)方法的建立

根據(jù)引物濃度，退火溫度條件反復(fù)試驗(yàn)最后確定單項(xiàng)PCR最佳反應(yīng)條件。單項(xiàng)PCR的反應(yīng)總體系25 μL，取DNA或反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板各2 μL、2.5 mM dNTP 2 μL、10×PCR Buffer（Mg2+） 2.5 μL、上下游引物各 0.5 μL、Taq 0.125 μL，加 ddH2O 補(bǔ)足 25 μL。單項(xiàng)PCR擴(kuò)增程序按以下步驟：94℃2 min、94℃30 s、54℃30s、72℃1min20s，32個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

1.2.5 多重PCR檢測(cè)方法的建立

以PCV2、CSFV和PRRSV單項(xiàng)PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)，對(duì)多重PCR各項(xiàng)條件進(jìn)行優(yōu)化。多重PCR的反應(yīng)體積為 25 μL：其中，2.5 mM dNTP 2 μL、10×PCR Buffer（Mg2+） 2.5 μL，模板各1.5 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq0.125 μL，然后加 ddH2O 補(bǔ)足 25 μL。按以下步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃2 min、94℃30 s、54℃30 s、72℃1 min 20 s，32個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.2.6 多重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

以提取的DNA和cDNA為模板，采用50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃進(jìn)行PCR擴(kuò)增，優(yōu)化退火溫度，確定多重PCR擴(kuò)增最佳退火溫度。

1.2.7 多重PCR靈敏性試驗(yàn)

將已知濃度3種病毒核酸混合，用ddH2O做10倍稀釋，取每個(gè)稀釋度的模板進(jìn)行PCR。

1.2.8 多重PCR特異性試驗(yàn)

采用優(yōu)化后的PCR體系及程序，分別以CSFV、PRRSV和PCV2，以及3種病毒的DNA或cDNA的混合物為模板；同時(shí)，以PRV、PPV、PEDV為陽(yáng)性對(duì)照，以滅菌雙氧水為陰性對(duì)照，用1.2.5反應(yīng)體系和程序進(jìn)行多重PCR。

1.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的多重PCR，用1.2.5反應(yīng)體系和程序重復(fù)檢測(cè)的CSFV、PRRSV和PCV2的單一病毒的cDNA或DNA以及DNA與cDNA的混合樣品3次，檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

用合成的3對(duì)引物分別對(duì)CSFV、PRRSV、PCV2進(jìn)行單項(xiàng)及多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1，可觀察到204 bp（CSFV）、314bp（PRRSV）、485bp（PCV2）的目的條帶，大小與預(yù)期相符，陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出條帶。

圖1 單一PCR擴(kuò)增和多重PCR擴(kuò)增

2.2 多重PCR退火溫度的優(yōu)化

選取不同的退火溫度（50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃）進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，不同退火溫度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響不大，最終選擇54℃作為多重PCR最佳退火溫度（圖2）。

2.3 靈敏性檢驗(yàn)結(jié)果

采用優(yōu)化后的條件來(lái)擴(kuò)增10倍稀釋的CSFV、PRRSV和PCV2的cDNA和DNA混合液，測(cè)得的多重PCR的最低檢測(cè)量分別為39.3 pg、55.1 pg和1.32 pg（見(jiàn)圖 3）。

圖2 多重PCR退火溫度的優(yōu)化

圖3 多重PCR敏感性擴(kuò)增結(jié)果

2.4 特異性檢驗(yàn)結(jié)果

按照已優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，PRV、PPV和PEDV及陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出條帶，CSFV、PRRSV和PCV2及3種混合模板可見(jiàn)清晰的條帶。通過(guò)測(cè)序鑒定：這些條帶均為目的片段，說(shuō)明該P(yáng)CR的特異性較好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

用建立的多重PCR在不同時(shí)間對(duì)每份陽(yáng)性樣品重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果均一致。說(shuō)明建立的多重PCR具有較好的穩(wěn)定性。

圖4 多重RT-PCR的特異性擴(kuò)增結(jié)果

2.6 多重PCR對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)96份疑似繁殖障礙病的母豬組織樣品進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，8份樣品檢出CSFV，24份樣品檢出PRRSV，75份樣品檢出PCV2；其中24份樣品為PCV2和PRRSV混合感染，8份樣品為PCV2和CSFV的混合感染。多重PCR檢測(cè)結(jié)果與單一RT-PCR檢測(cè)結(jié)果完全相符（表2）。

表2 96份病豬樣品經(jīng)多重PCR及單一PCR的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，文獻(xiàn)及臨床病料檢測(cè)結(jié)果表明，規(guī)?；i場(chǎng)所發(fā)生的母豬繁殖障礙性疾病大多為混合感染[6]，此類疾病中CSFV、PRRSV和PCV2是較為常見(jiàn)的病原，其中PCV2在豬場(chǎng)中普遍存在，臨床檢測(cè)陽(yáng)性率極高。

多重PCR反應(yīng)中，引物設(shè)計(jì)的好壞決定著多重PCR反應(yīng)的成敗[3]。設(shè)計(jì)引物時(shí)，所選基因片段中G＋C含量應(yīng)在55%～60%，引物長(zhǎng)度為20～21 bp，所擴(kuò)增的基因片段長(zhǎng)度容易區(qū)分，退火溫度相近，以確保不同引物在同一溫度下均能擴(kuò)增成功，并便于瓊脂糖凝膠電泳的觀察分辨。應(yīng)用多重PCR方法對(duì)96份可疑病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，在檢查的96份病料中，PCV2與PRRSV混合感染占比為25%，PCV2與CSFV混合感染占比為8.33%，PCV2、PRRSV和CSFV 3者混合感染占比為1.04%。說(shuō)明目前3種病毒對(duì)豬群的感染率較高，且多以混合感染為主。

圖5 多重PCR對(duì)部分臨床樣品的檢測(cè)

4 小結(jié)

試驗(yàn)通過(guò)自行設(shè)計(jì)3對(duì)引物，建立了同時(shí)檢測(cè)PCV2、PRRSV和CSFV 3種病毒的多重PCR，該P(yáng)CR可同時(shí)擴(kuò)增出204 bp（CSFV）、314 bp（PRRSV）和485 bp（PCV2）的目的條帶，為3種病毒檢測(cè)增加了一個(gè)新的渠道。該檢測(cè)方法對(duì)種豬場(chǎng)的實(shí)時(shí)監(jiān)控、凈化種豬群和推廣優(yōu)良種豬具有重要意義[3]。